184490. lajstromszámú szabadalom • Eljárás extracelluláris anyagot termelő sejtek előállítására
1 184 490 2 A mutánsok előállítása: Kinakrin mentes és 5,0 «g/rnl Q-t tartalmazó BP tápoldatot (3—3 ml, 3—3 parallelben) ÎO'* B. rnegaterium AL sejttel inkubáltunk és 30 °C-on 48 óráig tenyésztettünk. A tenyészetekből 50 yl-t friss, azonos Q tartalmú BP oldatban vittünk és a tenyésztést 48 órás periodicitással folyamatosan végeztük. Előkísérletben megállapítottuk, hogy a Q-nak az AL törzzsel szembeni minimális inhibitor koncentrációja 200 .«g/ml (BP közegben, felező léptékű sorozathígításos vizsgálat szerint). 5 "g/ml Q jelenlétében a 48 órás inkubálási periódus alatt kb. 80 %os sejtsűrűség jött létre a Q mentes kontroll tenyészethez képest, és ez az arány mindvégig megmaradt a tenyésztés során. Nyálkatermelő mutánsok izolálása Minden harmadik passzázs után a 48 órás tenyészetekből mintát vettünk, 100-szor hígítottuk MM tápoldattal, majd 50 /'1-t MM agarra szélesztettünk. 4 napos inkubálás (30 °C) után nyálkaképző telepek megjelenését vizsgáltuk. A 66. napon az 5 ,«g/ml Q tartalmú BP közegű tenyészet tesztelésekor nyálkaképző telepeket találtunk az MM agar lemezeken. A nyálkaképző mutáns sejtek előfordulási frekvenciája kb. 10~3 volt. A kontroll Q mentes BP tenyészetből nem volt kimutatható nyálkaképző mutáns a vizsgált periódusban. Az ilymódon izolált A1 típusú nyálkatermelő tenyészetet MM agaron közvetlenül átoltással tartottuk fenn egy hónapig, miközben a nyálkatermelés intenzitása változatlan maradt. Ezután a tenyészetet savó tartalmú vívőanyagban (OKI típusú) szuszpendáltuk és liofiloztük. A liofilezett anyagot MM agaron tesztelve az eredeti A1 törzs mellett egy újabb A2 törzs jelent meg mintegy 25 %-os arányban. A mutáns törzsek jellemzése B. megaterium AL törzs (kiindulási törzs). BP agaron a 24 órás tenyészet lapos, kb. 2 mm átmérőjű, szabályos szélű, kerek, krémszínű telepet képez. Véres agaron hasonló telepek, néhány nap után a telepek sötétebbé válnak. MM agaron nem képez telepet; arginin és leucinnal kiegészített MM agaron normál telepeket képez. A tenyészet jellegzetes föld szagú. Valamennyi táptalajon azonos a sejtek mikroszkópos alakja: lekerekített végű, nagy pálcák, hosszúk 3—4 «, amelyek zömében ikerpálcát alkotnak. A sejtek mozgása lassú, à pálcák merevek. Grám pozitív festődésű, kataláz pozitív sejtek. Egyik táptalajon sem képez tokot vagy nyálkát. A1 mutáns törzs BP agaron lassan kifejlődő telepeket képez, 48 órás inkubálás után a telepátmérő 1,0 mm. Kerek, épszélű, kissé domború, halványsárga föld szagú telepek. A sejtek alakja eltér az AL sejtekétől, vékony, rövid, kb. 1 hosszú, hajlékony pálcák, egyesével vagy párosával. A sejtek gyorsmozgásúak, mozgás során a pálca jelentősen meghajlik. A 24 órás tenyészet Gram labilis, később Gram negatív festődésűvé válik. A festett sejtek gömbszerűvé deformálódnak. Véres agaron fehér telepeket képez, a sejtek kissé hosszabbak, Gram negatívak. BP folyadékban ugyancsak Gra mnegatív pálcák vannak. MM agron és M—9 (+5 °'o szacharóz) agaron a tenyészet minden sejtjéből nyálkatelepek fejlődnek. A nyálka cseppszerű, színtelen, nagy viszkozitású, (nem folyik meg). 10—12 napig folyamatosan nő a nyálka mennyisége, magassága 3—4 mm, a nyálkatclep átmérője 4—6 mm (6—12 nap után). Sűrű telepképzés esetén a nyálka összefüggő, a teljes agarfelszínt beborítja. Míg BP agaron a sejtek csak kb. 7 napig életképesek (4 °C), addig az MM agaron a nyálkába ágyazott sejtek 1 hónapig életképesek. A sejtek zöme egyes pálca, hosszúk 1,5—2 a nyálkába ágyazott sejtek nem szaporodnak. 3000 g-vel 30 percig centrifugálva a sejtek többsége a nyálkába ágyazva marad. Az egyes sejtekhez nem rendelhető saját elhatárolt nyálkatömeg. A sejtek a nyálka tömegének töredékét (^1%) képezik. Gram pozitív festődésűek. MM folyadékban a sejtek formája hasonló az MM agaron tapasztalttal. Az egyes pálcákhoz fonalszerű nyálkaanyag tartozik, amelynek hossza a pálca hosszának 5—10-szerese. Valamennyi táptalajon a sejtek kataláz negatívok. Ha a természetes fehérjeépítő aminosavak közül az MM agarba 1—1 aminósavat teszünk (50 ,«g/ml), akkor az L-triptofán kivételével nincs változás a nyálkaképzés intenzitásában. L-triptofán jelenlétében azonban nincs nyálkaképzés, ill. sejtszaporodás. Argininnel és leucinnel egyidejűleg kiegészített MM agaron a nyálka tömege kb. fele, mint az MM agaron. Szacharóz mentes MM agaron nincs sejtszaporodás, ill. nyálkaképzés. 5% szacharózzal kiegészített BP agaron általában nincs nyálkaképzés, néhány telep esetében azonban ismételt passzálás eredményeképpen ezen a táptalajon is intenzív nyálkaképzés indult meg, a nyálka jellege hasonló volt, mint MM agaron. Az A1 törzs stabilan fenntartható MM és BP agaron is, a szubkultúrák megőrzik a nyálkatermelés képességét. A2 mutáns törzs BP agaron gyorsan növő, lapos, enyhén hullámos szélű, 24 órás inkubálás után 2,5—3 átmérőjű telepeket képez, amelyek később 5—7 mm-re megnőnek. A sejtek az AL pálcákhoz hasonlóak, de annál kissé vékonyabbak és hosszabbak (4—5 .«), a végek lekerekítettsége nem jellemző. Általában iker formában fordulnak elő, hajlamosak azonban 3—10 tagú fonal képzésére is. A pálcahossz kevésbé állandó, mint az AL típusnál. A sejtek mozgása lassú, a pálcák alakja nem változik. Véres agaron hasonló telepképzés és seitforma. MM agaron jó telepképző. Az első 4 napon a telep nem nyálkás, külleme a BP agaron kifejlődő telepekhez hasonló. A 4. naptól kezdődően a telepek közepén — ahol a sejtsűrűség nagyobb, mint a széleken — nyálkatermelés indul meg és ennek 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
