184490. lajstromszámú szabadalom • Eljárás extracelluláris anyagot termelő sejtek előállítására
1 184 490 2 A találmány tárgya eljárás új, poliszacharidtípusú extracelluláris bakteriális nyálka előállítására azzal jellemezve, hogy Bacillus genusba tartozó baktériumsejteket akridin típusú vegyülettel kezelünk, majd a nyálkatermelő sejteket izoláljuk, szacharózt is tartalmazó táptalajon tenyésztjük és a termelt nyálkát elkülönítjük. Ismeretes, hogy a baktériumok bizonyos fajai sajátos körülmények között extracelluláris tok, ill. nyálka képzésére képesek. A nyálkaanyag a sejtektől könnyen elválasztható. Kémiai természetüket illetően ezek a képletek általában poliszacharid típusú anyagokból épülnek fel. A Bacillus genus több faja, így a Bacillus megaterium esetében is a tokanyag polipeptid típusú vegyület. [Lásd: Ivánovics, G. and Bruckner, V. (1937) Zeitschrift für Immunitätsforschung 90. 304.] Ismeretes néhány B. megaterium mutáns, amelyek L—glutaminsavat (3,028,309 számú egyesült államokbeli szabadalom) fruktózt (3,306,752), 5’—inozinsavat (3,409,505) és 5’—inozinsavat és inozint (3,409,507) termelnek; a mutánsokat UV mutagenezissel állították elő. A mikrobiális poliszacharidokat kiterjedten alkalmazzák különböző ipari, pl. vegyi-, olaj-, textil-, papír-, élelmiszer- és gyógyszeripari célokra. Néhány közismert, nagy tömegben alkalmazott bakteriális poliszacharid: dextrán, xantán, curdlán, az Erwinia, Xanthomonas, Azotobacter fajok poliszacharidjai. (Lásd: Sutherland, J. W. and Ellwood, D. C.: Microbial Exopolysaccharides-Industrial polymers of current and future potential, 107—150. oldal. Microbial Technology, Current State, Future Prospects, 1979.) A bakteriális poliszacharidok előállítására különböző új technológiai és fiziológiai, ill. genetikai eljárásokat dolgoznak ki részint a termelés fokozása érdekében, részint pedig új kémiai szerkezetű poliszacharidok előállítására. A sokrétű alkalmazási lehetőség a bakteriális poliszacharidok széles skáláját igényli, és az új poliszacharidoknak új felhasználási területei is adódhatnak a fent említett iparágakban. Ezért tekinthető hasznos eredménynek, választékbővítésnek, ha olyan baktériumokat, jelen esetben Bacillus genusba tartozó baktériumokat, amelyek eddig poliszacharid típusú nyálkát nem termeltek, sikerül nyálkatermelésre bírni. A találmány szerinti eljárás alapja az, hogy a baktériumsejteket, előnyösen speciális auxotróf mutánsokat folyamatosan tenyésztjük egy hagyományos tápközegben, miközben akridin-típusú vegyület állandó hatásának tesszük ki a sejteket. Az eljárásban a kezelést előnyösen kinakrin hidrokloriddal végezzük. A hatóanyag koncentrációja a minimális inhibitor koncentrációnál lényegesen alacsonyabb, ezáltal a vegyület enyhe hatást fejt ki a sejtekre, aminek következtében sajátos módosulások, mutációk, ill. sejtszerkezeti — elsősorban sejtfelszíni — változások jönnek létre. Utólagosan alkalmazott liofilizálással a sejtek tulajdonságait tovább módosíthatjuk. A nyálkatermelő mutánsok izolálására és a kvantitatív nyálkatermelés megvalósítására hagyományos táptalajokat használunk szacharóz kiegészítéssel; az eljárás egyik előnyös formájában szacharóz kiegészítést tartalmazó minimál táptalajt alkalmazunk. A leírásban az előállított, új tulajdonságként nyálkatermelést mutató sejteket mutánsoknak nevezzük anélkül, hogy a tényleges DNS szintű változásokat megvizsgáltuk volna. A találmány szerinti eljárással előállított nyálka — amelynek fő komponense poliszacharid, ill. járulékosan aminosav típusú komponenseket is tartalmaz — felhasználása a szokásos módon, kémiai és fizikai jellegének megfelelően történhet. Kiviteli példa: Baktériumtörzs: A kísérletekben kiindulási törzsként arginint és leucint igénylő, kettős auxotróf Bacillus megaterium Arg-Leu- (röviden AL) mutáns törzset használtunk, amelyet az MTA SZBK Genetikai Intézete, Szeged kutatói engedtek át kísérleti célokra. A mutáns készítésének irodalma: Fodor, K. and Alföldi, L. (1976) Proceeding of the National Academy of Sciences of the United States of America 73, 2147. Tápközegek: Aminosavakat tartalmazó komplett tápoldatként a Bacto Penassay oldatot (BP) (Difco Manual No, B243) használtuk, ennek szilárd formája 1,5 % agart tartalmazott. Minimál táptalajként (MM) az irodalmi (Fodor K. és Alföldi L. : korábban idézett irodalom) hypertóniás táptalajt használtuk, amelynek összetétele: Tri.s.HCl (0.12 mol/liter, pH 7,5), glükóz (0,ll.mol/liter), szacharóz (0,145 rhol/liter', azaz 5 %) továbbá szervetlen sók és 1,5 % agar. Aminósav kiegészítés esetén az egyes L—aminósavakat 50 r/g/ml koncentrációban adtuk. A másik alkalmazott minimál táptalaj : M—9 (összetételét lásd: Winkler, U., Ruger, W., Wackernagel, W. (1976) Bacterial, Phage and Molecular Genetics, Oxford Press,' U. K.), amely glükózt (0,022 mol/liter), szervetlen sókat és 1,5 °/0 agart, továbbá kiegészítésként 0,146 mol/liter szacharózt tartalmazott. A két minimál táptalaj a nyálkatermelés céljára azonos értékűnek bizonyult. A bakteriológiai rutin vizsgálatokat, így a biokémiai teszteket és az antibiotikum meghatározásokat a Járványügyi és klinikai bakteriológia, Módszertani Útmutató, 1980., Országos Közegészségügyi Intézet, Budapest (szerkesztő Lányi Béla) előírásai szerint végeztük el. Az antibiotikum érzékenységi tesztekhez Resistest (Human) korongokat használtunk. Vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatok. A vizsgálatokhoz DC-Alufolien Kieselget 60, No. 5553 (Merck) kromatográfiás lapokat használtunk. Előhívó reagensek: (Lásd: Stahl, E. (1967) Dünnschicht-Chromatographie, Springer-Verlag, Berlin) ninhidrin (No. 176), timol-szulfonsav (No. 237). Liofïlezés: A ferde agaron kinőtt tenyészeteket az OKI által rendszeresített vívőanyagban szuszpendáltuk, majd liofileztük. A vivőanyag nyúlsavót, továbbá ciszteint, aszkorbinsavat, inozitot és K>HPO/-et (pH 7,0) tartalmazott vizes oldatban. (Irodalma: OKI Orvosi Baktériumok Nemzeti Gyűjteménye 1978, Budapest; összeállította Lányi B. és Konkoly Thege M.). Hatóanyag: Kinakrin x 2 HC1 (a továbbiakban: Q), a Serva terméke volt. 5 10 15 20 25 30 ■ ; i 35 40 45 50 55 60 65 2
