184468. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált kolinészteráz enzimkészítmény előállítására
1 184 468 2-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferoldattal készített oldatát. 10 perces keverés után az elegyhez 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferben oldott 60,1 mg kolinészterázt adtunk. A teljes reakcióidő 0—4 C°-on 48 óra volt, amelyből kétszer hat órát kevertük a szuszpenziót. Ezután szűrtük a gélt és háromszor 10 ml 0,1 mólos kálium-foszfát (pH = 7,0) pufferoldattal, majd háromszor 10 ml 0,5 mól nátrium-kloridot tartalmazó pufferoldattal (pH = 7,0), majd háromszor 10 ml 0,1 mólos káluim-foszfát (pH = 7,0) pufferoldattal mostuk. A gélt ezután négyszer 25 ml hideg desztillált vízzel sómentesre mostuk, majd liofilizáltuk. A kitermelés 144,7 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 80 ^mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag. 4. példa 200 mg Akrilex C—100 xerogélt (4 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, hideg kálium-foszfát (pH = 7,0) pufferben szuszpendáltunk. 0 C°-on, állandó keverés mellett 200 mg N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg (4 C°-os) puff erben készült oldatát adtuk. 10 perces keverés után 2,5 ml hideg (4 C°-os) kálium-foszfát pufferben oldott 50 mg kolinészterázt adtunk. A teljes reakcióidő 0—4 C°-on 48 óra volt, melyből kétszer hat órát kevertettünk. A továbbiakban a mosás megegyezett a fent (3.) leírtakkal. A kitermelés 220 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 240 .«mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag. 5. példa 249,8 mg Akrilex C—100 xerogélt (6,5 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, hideg kálium-foszfát pufferben (pH = 7,0) szuszpendáltunk. 0 C°-on, állandó keverés mellett 250 mg N-etil-N’-(3-dimetil-amino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg kálium-foszfát pufferben készült oldatát adtuk. 10 perc kevertetés után 50 mg kolinészterázt adtunk az elegyhez, melyet előzőleg 2,5 ml hideg pufferben oldottunk. A teljes reakcióidő 48 óra volt, melyből kétszer hat órát kevertettünk. A mosás megegyezett az előzőekben (3.) leírtakkal. A kitermelés 321 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 240 «mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag. 6. példa 300 mg Akrilex C—100 xerogélt (5,7 mekv/g -COOH) 5,0 ml hideg 0,1 mólos pufferben (pH = 7,0) szuszpendáltunk. Állandó keverés mellett 0 C°on 300 mg N-etil-N’-3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg pufferben készült oldatát adtuk hozzá. 10 perc keverés után 2,5 ml hideg pufferben oldott 50 mg kolinészterázt tettünk hozzá. A teljes reakcióidő 48 óra volt, melyből kétszer hat órát kevertettünk. A mosás a továbbiakban megegyezett az előzőekben (3.) leírtakkal. A kitermelés 340 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 215 ,«mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise perc/gramm szárazanyag. 7. példa 253,4 mg Akrilex C—100 xerogélt ( 7 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, hideg kálium-foszfát pufferben (pH = 7,0) szuszpendáltunk. 2,5 ml hideg puff erben oldott 130,8 mg N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidrokloridot adtunk hozzá. 10 perces kevertetés után 50,2 mg kolinészterázt adtunk az elegyhez, melyet előzőleg 2,5 ml hideg (4 C°-os) kálium-foszfát pufferben (pH = 7,0) oldottunk. A teljes reakcióidő 48 óra volt, melyből kétszer hat órát kevertettünk. A mosás megegyezett a fent (3.) leírtakkal. A kitermelés 355,9 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 252 ,«mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag. 8. példa 251,7 mg Akrilex C—100 xerogélt (3,5 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferben (pH = 7,0) szuszpendáltunk. 381,1 mg N-etil-N’-(3- -dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferben készült oldatát adtuk hozzá. 10 perc keverés után 50,2 mg kolinészteráz 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferben (pH == 7,0) készült oldatát tettük hozzá. A teljes reakcióidő 48 óra volt, ebből kétszer hat órát kevertettünk. A mosás megegyezett az előző példákban leírtakkal. A kitermelés 334,2 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 137 .«mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise,'perc,'gramm szárazanyag. 9. példa 256,1 mg Akrilex C—190 xerogélt (0,5 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos kálium-foszfát pufferben (pH = 7,0) szuszpendáltunk. 518,3 mg N-etil-N’-(3- -dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg pufferben készült oldatát adtuk hozzá. 10 perc keverés után 2,5 ml hideg pufferben oldott 49,3 mg kolinészterázt adtunk az elegyhez. A teljes reakcióidő 48 óra volt, melyből kétszer hat órát kevertettünk. A gél mosása megegyezett az előzőekben leírtakkal. A kitermelés 298,8 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 45,6 .«mól butiril-tiokolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag. 10. példa 256,7 mg Akrilex C—100 xerogélt (3,5 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, hideg kálium-foszfát oldatban (pH = 3,6) szuszpendáltunk. 131,8 mg N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimni-hidroklorid 2,5 ml hideg pufferben (pH = 3,6) készült oldatát adtuk az elegyhez. 10 perc keverés után 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
