184468. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált kolinészteráz enzimkészítmény előállítására
1 184 468 2 mer. gyártja a Koch-Light Laboratories Ltd., Colnbrook, Bucks, Nagy-Britannia) a gyártó cég előiratai szerint (Koch-Light Laboratories Ltd., KL 3, 344. oldal (1970)) savas közegben nátrium-nitrittel aktiváltunk. Ezután 100 mg aktivált hordozót, amely a funkciós csoportokat savazid csoportok formájában tartalmazta, és 2,5 mg kolinészterázt 0,1 mólos borát pufferoldatban (pH 8,0) kevertünk az a) pontban ismertetett körülmények között. c) 93 mg, Reanal gyártmányú, 2,3 mekv/g kötőkapacitású (-COOH tartalmú) karboximetil-cellulózt 5 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldatban (pH 7,0) szuszpendáltunk, majd állandó keverés közben hozzáadtunk 50 mg N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidrokloridot 2,5 ml hideg (4 C°os) pufferoldatban oldva. 10 perces keverés után a reakcióelegyhez 25 mg kolinészterázt adtunk 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferoldatban oldva. Az enzimet összesen 48 órán át reagáltattuk 0—4 C°-on az aktivált hordozóval; ebből kétszer 6 órán át kevertük az elegyet. d) Merck (Darmstadt, Német Szövetségi Köztársaság) gyártmányú polimaleinsav-anhidrid hordozót a gyártó cég előírásai szerint (Biochemies Merck: Poly/maleic anhydride/crosslinked enzyme support) kolinészterázzal kapcsoltunk: 1 g hordozót 25 ml 0 C°-os, 0,05 mólos káliumfoszfát pufferoldatban (pH 7,0) szuszpendáltunk, és 1 perces keverés után a szuszpenzióhoz 0, 5 g kolinészteráz 5 ml hideg (4 C°-os) pufferoldattal készített oldatát adtuk. A reakcióelegy pH-ját 1 n vizes nátriumhidroxid oldat folyamatos adagolásával 8 és 9 közötti értéken tartottuk. A lúgot addig adagoltuk, amíg az elegy pH-ja kb. 0,5 órán át tovább már nem változott. Az a—d) pontban ismertetett immobilizálási reakciók lezajlása után az immobilizált enzimkészítményeket szűrtük vagy centrifugáltuk, majd az immobilizálásnál alkalmazott pufferoldattal, 0,5— 5 1,0 mólos, pufferoldattal készített nátriumklorid oldattal, végül ismét az immobilizálásánál alkalmazott pufferoldattal mostuk a nem kovalensen kötött fehérjék eltávolítására. Ezután a pufferoldat ionjait vizes mosással eltávolítottuk, és az immobi- 10 lizált enzimkészítményt liofilizáltuk. A liofilizált termékeket hűtőszekrényben 4 C°-on tároltuk. Az immobilizált enzimkészítményeken megkötött fehérje mennyiségét közvetett úton, a reakcióelegybe bevitt és az immobilizálási eljárás után a 15 felülúszóban és a mosófolyadékokban maradt fehérjemennyiség különbségeként határoztuk meg. A kolinészteráz-oldatok fehérjetartalmának meghatározására a biuret-módszert (A. C. Gornall, C. S. Bardswill, M. M. David: J. Biol. Chem. 177, 751 20 (1949)) alkalmaztuk. Az oldott és az immobilizált kolinészterázok aktivitását a butiril-tio-kolin-jodid szubsztrátum bontása során felszabaduló szulfhidril-csoportok meghatározásával mértük. A szulfhidril-csoportokat 25 bisz(5-karboxi-4-nitro-fenil)-di-szulfiddal határoztuk meg (G. L. Ellman, K. D. Courtney, V. Andres Jr., R. M. Featherstone : Biochem. Pharmacol. 7, 88 (1961)). Egy aktivitási egységnek azt az enzimmennyiséget tekintettük, amely 1 mikromól bu- 30 tiril-tio-kolin-jodid átalakulását katalizálja percenként 25 C°-on, a katalitikus aktivitás optimális pH-értékén (oldott enzim esetén: pH = 7,6; immobilizált enzim esetén: pH = 8,0). A végzett kísérletek eredményeit az 1. táblázat- 35 ban közöljük. 1. táblázat Hordozó Immobilizált fehérje, % Immobilizált aktivitás, % Oldott állapotban visszanyert aktivitás, % Aktivitásveszteség % A termék* aktivitása Fajlagos** aktivitás, % Enzacryl AA 100 0 0 100 0 0 Enzacryl AH 61,8 0,2 60,7 39,1 0,2 0,3 Akrilex C—100 24,5 7,5 60 32,5 120 30,6 (1. példa) Karboximetil-cellulóz 5,5 0,2 3,5 96,3 2 3,6 Polimaleinsav-anhidrid 23,3 7,5 31,3 61,2 106 32,2 * egység/mg szárazanyag. ** Az oldott enzim fajlagos aktivitását tekintettük 100%-nak. Az 1. táblázat adataiból megállapítható, hogy száraz súlyra (fehérje+hordozó), illetve fehérjetartalomra vonatkoztatva a legnagyobb aktivitású terméket a találmány szerinti eljárással kapjuk. A polimaleinsav-anhidrid hordozó felhasználásával kapott termék aktivitási adatai közel esnek a találmány szerint előállított termékéhez; ez a hordozóanyag azonban tömbpolimerizációval készült, így az immobilizált enzimkészítményből előállított oszlop átfolyási jellemzői lényegesen rosszabbak a találmány szerint előállított, gyöngyhordozón immobilizált termékénél. 60 3. példa 99,8 mg Akrilex S—100 xerogélt (0,8 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos, pH = 7,0 kálum-foszfát pufferben szuszpendáltunk, majd 0 C°-on állandó 65 keverés mellett hozzáadtunk 108,6 mg N-etil-N’-(3-4
