184468. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált kolinészteráz enzimkészítmény előállítására
t 184 468 2 metakrilamid részegységekből akril- vagy allil-típusú térhálósítószerrel felépített, 0,1—8 mekv/g -COOH funkciós csoportot tartalmazó polimer gyantát vízben oldható, vagy 0 C° alatti hőmérsékleteken szerves oldószerekben oldható karbodiimid vegyülettel kezelünk, az így aktivált hordozóra 4,5 és 8,5 közötti pH-értékű oldatban kolinészterázt viszünk fel, a kapott terméket mossuk, végül kívánt esetben szárítjuk. Polimerként különösen előnyösen használhatjuk fel a korábban ismertetett Akrilax C típusú polimereket. A találmány szerinti eljárásban enzimként tetszés szerinti eredetű, bármilyen ismert módon elkülönített kolinészteránzt felhasználhatunk. Az enzimhordozó kopolimer aktiválására karbodiimid-vegyületként például N-ciklohexil-N’-(/?-/N-metil-morfilin/-etil)-karbodiimid-p-touolszulfonátot vagy N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidrokloridot használhatunk fel. Karbodiimid-vegyületként előnyösen vízben oldható anyagokat alkalmazunk. A csak szerves oldószerekben oldható karbodiimid-vegyületek közül a találmány szerinti eljárásban azok a származékok használhatók fel, amelyek az adott szerves oldószerben hidegen (azaz 0 C°-nál alacsonyabb hőmérsékleten) is megfelelően oldódnak. Az aktivált hordozóra 4,5 és 8,5 közötti pH-értékű — előnyösen pH 7,0-es — oldatból visszük fel a kolinészterázt. A kolinészterázt célszerűen 0,1 mólos káliumfoszfát puffer-oldatban (pH 7,0) oldott állapotban használjuk fel. A kapcsolási reakcióval kialakított immobilizált enzimkészítményt ismert módon mossuk, majd kívánt esetben szárítjuk. Az enzimkészítmény azonban — 0—4 C°-on — vizes szuszpenzióban is eltartható. A találmány szerinti eljárással előállított immobilizált enzimkészítmények fajlagos aktivitása 100—120 egység/g xerogél, ami az Anal. Chem. 37, 1378 (1965), Anal. Biochem. 19, 587 (1967), Biochim. Biophys. Acta 212, 362 (1970) és Anal. Biochem. 51, 362 (1973) közlemények aktivitás-adataival összehasonlítva kedvezőnek tekinthető a gyakorlati felhasználás szempontjából. Az eljárásunkkal előállított immobilizált kolinészteráz enyhén lúgos közegben, tehát alkalmazásának optimális pH-ján (pH 8,0) nagyobb stabili-^ást mutat, mint az oldható enzim. Ez jelentős .lőny a tartós használat szempontjából. A találmány szerinti eljárást az oltalmi kör korlátozása nélkül az alábbi példákban részletesen ismertetjük. 1. példa 100,6 mg akrilamid-akrilsav-N,N-metilén-bisz-akrilamid (Akrilex C—100) xerogélt (3 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldatban (pH 7,0) szuszpendáltunk, majd 0 C°-on állandó keverés közben hozzáadtuk 102,5 mg N-etil-N’-(3-dimetilamino-propil)-karbodiimid-hidroklorid 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferoldattal készített oldatát. 10 perces keverés után a reakcióelegyhez 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferoldatban oldott 47,4 mg kolinészterázt adtunk. A teljes reakcióidő 0—4 C°on 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órán át kevertük a szuszpenziót. Ezután a gélt szűréssel elválasztottuk, és háromszor 10 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldattal (pH 7,0), háromszor 10 ml, 0,5 mólos nátriumkloridot tartalmazó 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldattal (pH 7,0), majd háromszor 10 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldattal (pH 7,0) mostuk. Végül a gélt négyszer 25 ml desztillált vízzel sómentesre mostuk, majd liofilizáltuk. Kitermelés: 106,2 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás: 120 «mól butiril-tio-kolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag. 2. példa 102 mg Aklirex C—100 xerolgélt (2 mekv/g -COOH) 5,0 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldatban (pH 7,0) szuszpendáltunk, majd 0 C°-on, állandó keverés közben 202 mg N-ciklohexil-N’-(/S-/N- metil-morfilin/-etil)-karbodíimid-p-toluolszulfonát 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferoldattal készített oldatát adtuk a szuszpenzióhoz. 10 perces keverés után a reakcióelegyhez 2,5 ml hideg (4 C°-os) pufferoldatban oldott 49 mg holinészterázt adtunk. A teljes reakcióidő 0—4 C°-on 48 óra volt, amelyből kétszer 6 órán át kevertük az elegyet. Ezután a gélt szűréssel elválasztottuk, és háromszor 10 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldattal (pH 7,0), háromszor 10 ml, 0,5 mól nátriumkloridot tartalmazó 0,1 molos káliumfoszfát pufferoldattal (pH 7,0), majd háromszor 10 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldattal (pH 7,0) mostuk. Végül a gélt négyszer 25 ml desztillált vízzel sómentesre mostuk, majd liofilizáltuk. Kitermelés: 110 mg immobilizált kolinészteráz. Aktivitás 110 .«mól butiril-tio-kolin-jodid hidrolízise/perc/gramm szárazanyag. összehasonlító vizsgálatok és azok eredményei: A találmány szerint előállított immobilizált enzimkészítmények aktivitását és fajlagos aktivitását egyéb hordozóanyagokon immobilizált enzimkészítmények megfelelő adataival hasonlítottuk össze. A következő összehasonlító anyagokat használtuk fel: a) Enzacryl AA típusú hordozót (aromás amin funkciós csoportokat tartalmazó akrilamid — N,N’-metilén-bisz-akrilamid kopolimer, gyártja a Koch- Light Laboratories Ltd., Colnbrook, Bucks, Nagy- Britannia) a gyártó cég erőiratai szerint (Koch- Light Laboratories Ltd., KL 3, 343 oldal (1970)) diszoláltunk. Ezután 100 mg diszotált Enzacryl AA-t és 2,5 mg kolinészterázt 0,5 ml 0,1 mólos káliumfoszfát pufferoldatban (pH 7,5) kevertettünk 0—4 C°-on kétszer 8 órán keresztül úgy, hogy a két keverési időszak között, valamint a keverési időszak végén a szuszpenziót 16—16 órán át hűtőszekrényben 4 C°-on állni hagytuk. b) Enzakryl AH típusú hordozót (akrilamid-akrilsav-hidrazid-N,N’-metilén-bisz-akrilamid kopoli-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
