184468. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immobilizált kolinészteráz enzimkészítmény előállítására
1 184 468 2 A találmány tárgya eljárás új típusú, immobilizált kolinészteráz enzinkészítmény előállítására. Ismeretes, hogy a kolinészteráz enzim, amelyet a leggyakrabban ló vérsavóból izolálnak, alkalmas foszforsav-észter-, karbamát- és szulfátészter-típusú idegmérgek kimutatására, valamint a levegőben vagy vízben előforduló idegmérgek mennyiségének meghatározására. A kimutatás és a mérés alapja ezeknek a mérgező anyagoknak az enzimre gyakorolt gátló hatása. Az immobilizált kolinészteráz-enzimkészítmények folyamatosan működő mérőrendszerek központi elemei lehetnek. Ilyen mérőrendszerek elvét ismerteti például az Anal. Chem. 37, 1378 (1965) és az Anal. Biochem. 51, 362 (1973) közlemény. A ló vérsavójából elkülönített kolinészteráz immobilizálására több módszert ismertettek a szakirodalomban. Az enzim különböző gélekbe — elsősorban keményítőgélekbe — történő bezárását ismerteti az Anal. Chem. 37, 1378 (1965), Anal. Biochem. 19, 587 (1967) és Anal. Biochem. 33, 341 (1970) közlemény, valamint a 3 223 593 sz. Amerikai Egyesült Allamok-beli szabadalmi leírás. Ez a szabadalmi leírás az enzim agar- és carrageengélekbe való bezárását is ismerteti. Bezáró közegként poliakrilamid használatát ajánlja a Biochim. Biophys. Acta 212, 362 (1970) és az Anal. Biochem. 33, 341 (1970) közlemény. Az enzim továbbá funkciós csoportokkal rendelkező, polimer makromolekulákhoz kapcsolható kovalens kötéseken keresztül. Így például a Biochim. Biophys. Acta 191, 478 (1969) közlemény szerint az enzimet előzetesen ciánbromiddal aktivált Sepharose 2B-n immobilizálják, míg a Biochim. Biophys. Acta 377, 297 (1975) közlemény szerint hordozóként polialeinsavenhidridet alkalmaznak. A Clin. Chim. Acta 121, 125 (1980) közlemény szerint az enzimet karbodiimides vagy glutárealdehides kapcsolással nem-porózus üvegen immobilizálják, míg a 707 923 sz. szovjet szabadalmi leírás szerint az enzimet aktivált porózus üveghez vagy szilika gélhez kötik. Aktivizálószerként cianursav-kloridot használnak fel. A Can. J. Biochem. 48, 1314 (1970) közlemény szerint a ló vérsavó kolinészteráz Procion brilliant orange DEAE-cellulóz komplexen is megköthető kovalens kötéseken keresztül. Az ismert eljárásokkal előállított, gélbe zárt kolinészteráz-enzimkészítményekből az enzim folyamatosan kioldódik, ezért a készítménvek hosszú idejű, tartós felhasználásra nem alkalmasak. A szubsztrátumon kovalens kötésekkel immobilizált kolinészteráz-enzimkészítmények átfolyási tulajdonságai kedvezőtlenek az automata rendszerekben történő alkalmazás szempontjából, ezen túlmenően egyes hordozóanyagok (így a Sepharose 2B) mikrobiális behatásokra érzékenyek. A találmány célja a fenti hiányosságok kiküszöbölése. A találmány értelmében olyan immobilizált kolinészteráz-enzimkészítménveket kívánunk előállítani, amelyek tartós felhasználásra alkalmasok, és az enzimet kémiailag ismert, mikroorganizmusok hatásának korlátlanul ellenálló, jó mechanikai tulajdonságokkal rendelkező, nagy átfolyási sebességet biztosító hordozóhoz kötött állapotban tartalmazzák. További követelmény, hogy az enzim enyhe reakciókörülmények között kapcsolható legyen a hordozóanyaghoz. Tapasztalataink szerint az akrilsav és/vagy metakrilsav, valamint akrilamid és/vagy metakrilamid monomerekből akril- vagy allil-típusú térhálósítószerrel (így N,N’-metilén-bisz-arkilamiddal, etilén-diakriláttal, vagy N,N’-diallil-borkősavamiddal) felépített, legalább 0,1 mekv/g (célszerűen 2—8 mekv/g) -COOH funkciós csoportot tartalmazó polimer gyanták teljes mértékben megfelelnek a hordozóanyagokkal szemben támasztott követelményeknek. Ezeket az enzimhordozókat önmagukban ismert módszerekkel állíthatjuk elő. Eljárhatunk például úgy, hogy akrilamidot és/vagy metakrilamidot térhálósító monomer jelenlétében akrilsawal és/vagy metakrilsawal kopolimerizálunk, míg egy másik lehetséges eljárásmód szerint először akrilamidból és/vagy metakrilamidból állítunk elő térhálós polimert a fenti térhálósítók segítségével, majd a kapott polimer savamid-csoportjainak részleges hidrolízisével alakítjuk ki a kívánt mennyiségű -COOH funkciós csoportot. Az utóbbi típusba tartoznak például a Reanal Finomvegyszergyár (Budapest) által forgalomba hozott, Akrilex P típusú akrilamid — N,N’-metilén-bisz-akrilamid kopolimer gyöngyök (Akrilex P—30, P—100 és P— 200) savval (például sósavval vagy egyéb erős savval) vagy lúggal (például nátriumhidroxiddal, nátriumkarbonáttal vagy egyéb erős bázissal) végzett részleges hidrolízise során képződő, Akrilex C típusú enzimhordozók. Ezekben az anyagokban a hidrolízis során -CO-NH2 csoportok körülbelül 50 %-a alakul át karboxil-csoporttá, míg a -CO-NH2 csoportok fennmaradó része még erélyes reakciókörülmények között sem hidrolizál. A részlegesen hidrolizált kopolimerben tehát a karboxil-csoportok közé változatlan -CO-NH2 csoportok ékelődnek, amelyek a karboxil-csoportok kedvező térbeli eloszlását biztosítják. Ha a kialakított karboxil-csoportokhoz önmagában ismert karbodiimides aktiválással enzimet kapcsolunk, az immobilizált enzim-molekulák a karboxil-csoportok kedvező térbeli elhelyezkedése következtében nem gátolják egymás működését; így az immobilizált enzimkészítmény fajlagos aktivitása igen nagy érték lehet. Ugyanezekkel az előnyös tulajdonságokkal rendelkeznek az egyéb módon előállított, akrilsav és/vagy metakrilsav, valamint akrilamid és/vagy metakrilamid monomereket térhálósító, bifunkciós monomerrel összekapcsolt állapotban tartalmazó, 0,1—8 mekv/g -COOH funkciós csoportot hordozó polimerek is. Ezek a polimerek gyöngyalakúak, így nagy átfolyási sebességet biztosítanak, ugyanakkor kémiailag ismertek, és a mikroorganizmusok hatásának teljes mértékben ellenállnak. A felhasználandó enzimhordozók karboxil funkciós csoportjai az önmagában ismert karbodiinides aktiválással aktivizálhatók, és így alkalmassá válnak a kolinészteráz enzim megkötésére. Ez a reakció enyhe körülmények (0—4 C°, pH 7,0) között is végrehajtható. A találmány tárgya tehát eljárás immobilizált kolinészteráz-enzimkészítmény előállítására. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy akrilsav és/vagy metakrilsav, valamint akrilamid és/vagy 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
