184368. lajstromszámú szabadalom • Eeljárás D-fenilalanil-L-prolil-L-arginin-aldehid-szuklfát előállítására
1 2 184 368 A találmány tárgya eljárás vizes oldatban is nagy stabilitással rendelkező új D-fenilalanil-L-prolil-L-argininaldehid-szulfát előállítására. Ismeretes, hogy az antikoaguláns terápiában ez idő szerint a heparint és a hasonló szerkezetű polianionokat (hepa- g rinoidok), valamint a kumarin-származékokat használják. E vegyületek közös jellemzője, hogy a véralvadáshoz vezető proteolitikus reakciókat nem közvetlenül gátolják. A heparin mint katalizátor gyorsítja az egyik plazma-inhibitor, az antitrombin-in és az alvadási folyamat enzimjeinek, el- ^ q sősorban a trombinnak a gátlási reakcióját. A kumarinszármazékok pedig a 7-karboxi-glutaminsav(Gla)tartalmú fehérjék bioszintézisét gátolják. A véralvadásban négy ilyen típusú fehérje vesz részt, például a protrombin. A Gla-részeket nem vagy nem kellő számban tartalmazó ^ g véralvadási faktorok inaktívak, az alvadási folyamatban nem vesznek részt. Megjegyzendő, hogy a szintézisgátlás általánosan érvényesül, tehát például az alvadási folyamat egyik természetes inhibitora az ún. C-fehérje (vagy XTV-es faktor) is inaktív formában szintetizálódik kumarin- jr. származékok jelenlétében, ami már nem előnyös. Jellemző az is, hogy a heparint elsősorban intravénás infúzióban alkalmazzák, orálisan gyakorlatilag hatástalan, míg a kumarin-származékok csak orálisan adhatók. A heparin hatása a beadás után rövid időn belül jelentkezik, a 25 kumarin-származékoké — minthogy szintézis-gátlók — csak 24—36 óra múltán. Ismeretes továbbá, hogy némely tripeptid-aldehid ugyancsak rendelkezik antikoaguláns hatással, és a fentiektől eltérően közvetlenül hat a trombinra, antitrombin-HI 30 távollétében is gátolja annak proteolitikus reakcióit. Ilyen például a 169 870 sz. magyar szabadalmi leírásban ismertetett D-fenilalanil-L-prolil-L-arginin-aldehid-acetát. Hasonlóan nagy hatású trombin-inhibitor a 880 844 sz. belga szabadalmi leírásban ismertetett D-fenilalanil-L-prolil- 35 NG-karboxi-L-arginin-aldehid. Megfigyelésünk szerint a fenti szintetikus argininpeptid-aldehidek sói, különösen a szabad amino-terminálist tartalmazó vegyületek, mint például a leírt D-fenilalanil-L-prolil-L-arginin-aldehid-acetát és -klórhidrát an- 40 titrombin hatása változó, és vizes oldatban való állás közben gyorsan csökken, ami a terápiás felhasználást lehetetlenné teszi. A szabad tripeptid-aldehidek NG-karboxiszármazéka, például a D-fenilalanil-L-prolil-NG-karboxi-L-arginin-aldehid vizes puffer-oldatban20—24 óráig megőrzi ugyan aktivitását, de néhány nap után már jelentős aktivitáscsökkenés tapasztalható, és néhány hónap után szilárd állapotban is veszít eredeti hatékonyságából. A találmány célja eljárás biztosítása a D-fenilalanil-L- prolil-L-arginin-aldehid új, az ismertektől eltérően vizes oldatban is állandó sójának előállítására. Meglepő módon azt találtuk, hogy a D-fenilalanil-L-prolil-L-arginin-aldehid-szulfát hosszú időn keresztül vizes oldatban is megőrzi stabilitását. Megvizsgálva a D-fenilalanil-L-prolil-L-arginin-aldehid különféle sóinak stabilitását vizes oldatban, például fiziológiás konyhasó-oldatban, azok jelentősen különböznek. Vizsgálataink során a peptideket 10 mg/ml töménységben oldottuk, és az oldott anyagok antitrombin aktivitásának változását 180 napon át követtük. Az oldatokat 5 °C-on tároltuk. Az aktivitási értékeket az alábbi komponensekből álló rendszerben határoztuk meg: 0,2 ml 0,5%-os marhafibrinogén 0,9%-os konyhasóoldatban, 0,1 ml trisz(hidroximetil)-amino-metán-klórhidrátsósav puffer (pH = 7,2), amely a peptid-oldatot tartalmazza és 0,1 ml US Standard Human Thrombin (NIH, Bethseda, Maryland, USA) 10 egység/ml oldat. A rendszer alvadási ideje a peptid nélkül 15 s „Schnither- Gross Coagulometer’-ben meghatározva. A tripeptidaldehid-só aktivitását 100-nak vettük, ha 3,5 x 10‘7 mól reakcióelegy végkoncentrációban (a tripeptid-aldehid-szulfát esetében 0,175 /tg/ml reakcióelegy) ötszörös relatív alvadási időt eredményezett. A vizsgálatok eredményeit az I. táblázatban foglaltuk össze. Ebből kitűnik, hogy amíg a megfelelő klórhidrát kezdeti aktivitása fiziológiás konyhasó-oldatban 5 nap után, az acetát, a citrát, a tartarát, valamint a tozilát aktivitása pedig már néhány nap után csökkenni kezd (hasonló tulajdonságú a szabad tripeptid-aldehid N°-karboxiszármazéka is), addig a találmány szerinti D-fenilalanil-LTripeptid-aldehid-származékok antitrombin aktivitásának változása fiziológiás konyhasó-oldatban I. táblázat Peptid-aldehid“ Relatív aktivitás* 0 5 10 15 20 40 90 nap után D-Phe-Pro-Arg-H • 2CH3COOH“í D-Phe-Pro-Arg.-H.2HCl“ D-Phe-Pro-Arg(COOH)-H“ D-Phe-Pro- Arg-H • H2SO/ 70-50 60-40 40-30 40-30 40-30 35-25 30-20 90-60 90—60 80—50 70—40 60-40 50—30 40—30 100 80 60 50 30 25 20 100 100 100 100 100 100 100 “ A rövidítések megfelelnek a szakirodalomnak [például J. Biol. Chem., 247, 977 (1972)], valamint Z jelentése benziloxi-karbonil-csoport, Arg(COOH) és Arg(Z) jelentése Nc-karboxi-, illetve Nc-benziloxi-karbonil-L-arginin csoport. 4 Az antitrombin aktivitás 100, ha a peptid-aldehid 3,5 x 10"7M reakcióelegy végkoncentrációban ötszörös relatív alvadási időt eredményez. ‘ A Z-D-Phe-Pro-Arg(Z)-H ekvivalens mennyiségű sav jelenlétében végzett hidrogenolízisével előállított termék. a Az acetáthoz hasonlóan változik a megfelelő citrát, tartarát és tozilát antitrombin aktivitása. ■ A 880 844 sz. belga szabadalmi leírás szerinti módon előállított termék. ' A jelen találmány szerinti módon előállított termék. 2
