183945. lajstromszámú szabadalom • Eljárás timozin Ó1 szekvencia fragmenseinek előállítására
1 2 183 945 percig frissen készített, 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezeljük. Az oldószert és a sav fölöslegét 30 C°-on lepároljuk, és a maradékról két ízben tetrahidrofuránt párolunk le. A kapott maradékot éteres kezeléssel megszilárdítjuk. A kivált HCl.H-Lys(Z)Lys(Z)-OH-t leszűrjük és éterei többször mossuk. A kapott 6,7 g fehér, porszerű anyagot 70 ml dimetil-formamidban oldjuk, az oldatot jégfürdőn hűtjük, és 1,63 ml Et3Nt, majd 3,54 g (12,76 mmól) Boc-Glu(OBzl)OSu-t adunk hozzá, az elegyet 1 órán át 0 C°-on, majd 24 órán át 25 C°-on keverjük; ezalatt az elegy pH-ját Et3N időnkénti beadagolásával 7,5-ön tartjuk. A reakcióelegyet kevés ecetsavval pH=3,5 értékre savanyítjuk, és az oldószert lepároljuk. A kapott maradékot etilacetátban felvesszük, az oldatot vízzel háromszor mosuk, vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítjuk, és szárazra pároljuk. A kapott, félig megszilárdult maradékot éterrel eldörzsöljük, majd etilacetátból átkristályosítjuk. 7,26 g (69,5%) Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH-t kapunk: op. : 153—155 C°, [a] = -2,71° (c=l, THF). 1,7 g (1,16 mmól) Boc-glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t 30 percig 24 ml trifluorecetsavval kezelünk. A sav fölöslegét 30 C°-on lepároljuk, és a maradékot éterrel eldörzsöljük. A kapott porszerű anyagot éterrel és petroléterrel alaposan mossuk, és vákuumban nátrium-hidroxid fölött szárítjuk. 1,71 g trifluoracetát-sót kapunk. 0,998 g (1,16 mmól) Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH, 0,16 g (1,4 mmól) HOSu, 0,274 g (1,33 mmól) DCC és 15 ml dimetilformamid elegyét 3 órán át 0 C-on keverjük. A kapott oldathoz, amely Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-OSu-t tartalmaz, 1,71 g CF3COOH.H-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glui(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Ans-OBzl-t és 0,2 ml Et3N-t adunk. Az elegyhez 15 ml dimetilformamidot és még néhány csepp Et3N-t adunk, és a kapott elegyet 3 napig 25 C-on keverjük. Célszerű, félig szilárd anyag képződik. Az elegyet ecetsavval megsavanyítjuk és vízzel kezeljük. A kivált fehér, szilárd'anyagot leszűrjük, egymás után vízzel, metanollal és éterrel mossuk. A kapott 2,25 g nyers terméket (op.: 310—313 C°) dimetil-formamidban oldjuk, majd metanollal kicsapjuk. 1,75 g (68,3%) Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu (OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)~-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 314-316 C°, [a]-^ = 13,68° (c = 1, DMSO). A termék vékonyrétegkromatográfiás elemzés alapján egységes. 0,5 g (0,226 mmól) Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)Lys-(Z)-Glu (OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t 2 ml trifluor-ecetsavban oldunk, az oldathoz 15 ml hidrogénfluoridot adunk, és az elegyet 15 percig 0 C-on keverjük. A sav fölöslegét 0 C°-on lepároljuk. A maradékot 5% -os vizes ecetsav-oldatban oldjuk, az oldatot éterrel háromszor mossuk, kis térfogatra bepároljuk, és a maradékot fagyasztva szárítjuk. 0,34 g nyers terméket kapunk. A nyers terméket a korábban ismertetett módon ioncserés oszlopkromatográfiával tisztítjuk. 0,0 g (42,1%) tiszta H-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH-t kapunk; [a] ^ = -85,65° (c=l, víz). 3. példa 4,0 g (12,2 mmól) Boc-Leu-OSu-t 75 ml dimetilformamidban, 1,7 ml ET3N jelenlétében 48 órán át 3,42 g (12,2 mmól) H-Lys(Z)-OH-val kondenzálunk. A reakcióelegy pH-ját Et3N időnkénti beadagolásával 7,5 értéken tartjuk. Az oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. A kapott üvegszűrő, habos anyagot 200 ml éterben oldjuk, és az oldathoz 3 ml DCHA-t adunk. A kivált kristályos anyagot leszűrjük, éterrel mossuk, majd metanolból és éterből átkristályosítjuk. 5,7 g (69,5%) Boc-Leu-Lys(Z)-OH.DCHA-t kapunk; op.: 140-142 C°, [a]-^ = -7,20° (c=l, metanol). 2,97 g (4,4 mmól) Boc-Leu-Lys(Z)-OH.DCHA-t etilacetát és 0,1 n vizes kénsavoldat között megoszlatunk, majd a szabad savat elkülönítjük. A kapott 2,2 g színtelen, olajos anyagot 30 percig 40 ml 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezeljük. A sav fölöslegét és az oldószert 30 C-on lepároljuk, és a maradékot éterrel kezeljük. A kapott olajos anyagot éterben oldjuk, és az oldatot bepároljuk. Ezt a műveletet még kétszer megismételjük. A kapott maradékhoz 1,85 g (4,4 mmól) Boc-Asp(OBzl)-OSu-t és 1,85 ml Et3N-t adunk, és az elegyet éjszakán át keverjük. Ezután a reakcióelegyet szárazra pároljuk. Az olajos maradékot etilacetátban felvesszük, az oldatot vízzel háromszor mossuk, vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítjuk, és ismét szárazra pároljuk. A kapott nyers terméket etilacetátból és petroléterből kristályosítjuk. 1,52 g (49,6%) tiszta Boc-Asp(ABzl)-Leu-Lys(Z)-OH-t kapunk; op.: 109-111 C° [a]^j = -16,14° (c=l, DMF). 1,2 g (0,545 mmól) Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu (OBzl)-Asn-OBzl-t 30 percig 35 ml trifluorecetsavval kezelünk. A sav fölöslegét gyors ütemben lepároljuk, és a maradékot éterrel többször eldörzsöljük. Fehér, porszerű anyagként 1,2 g undekapeptid-TFA-sót kapunk. Ez a vegyületet 5 ml dimetil-formamid és 2 ml dimetil-szulfoxid elegyében oldjuk, és Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OSuval reagáltatjuk. A reagens előállítása során 0,381 g (0,545 mmól) Boc-Asp(OBzl)-Leu-Lys(Z)-OH, 0,126 g (1,1 mmól) HOSu, 0,124 g (0,599 mmól) DCC és 3 ml dimetil-formamid elegyét 3 órán át 0 C°-on keverjük; a kapott elegyet közvetlenül felhasználjuk a reakcióhoz. Az aktív tripeptid-észtert és az undekapeptidet tartalmazó elegyet 2 órán át 0 C°-on, majd 3 napig 25 C°-on keverjük, ezalatt az enyhén lúgos kémhatás biztosítására az elegyhez időről-időre Et3N-t adunk. A képződött kocsonyás anyagot 5%-os vizes ecetsavval eldörzsöljük. A kivált fehér, szilárd anyagot leszűrjük, vízzel, metanollal és éterrel mossuk, majd az így kapott 1,28 g nyers terméket (op.: 325—326 C°) 10 ml dimetil-formamid és 5 ml dimetil-szulfoxid elegyéből 230 ml metanollal kicsapjuk. 1,22 g (80,2%) tiszta Boc-Asp(OBzl)-Lau-Lys(Z)-Glu (OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzl)-Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op. : 326-327 C°, [a]^y = -15,71° (c=l, DMF(DMSO). 1,128 g (0,404 mmól), a fentiek szerint előállított terméket 7 ml anizolban 15 percig 0 C°-on 25 ml vízmentes hidrogénfluoriddal reagáltatunk. A sav fölöslegét 0 C°-on lepároljuk, és a kapott maradékot éter és víz között megosztjuk. A vizes fázist éterrel kétszer mossuk, eredeti térfogatának felére bepároljuk, és a koncentrátumot fa5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
