183945. lajstromszámú szabadalom • Eljárás timozin Ó1 szekvencia fragmenseinek előállítására
1 2 183 945 dékot petroléteres kezeléssel megszilárdítjuk, majd izopropanolból átkristályosítjuk. 28.9 g (59,8%) Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 169-175 C°, [a]^ = -11,78° (c=l, DMF). 3,9 g (3,48 mmól) Boc-Glu(OBzl)-glu(OBzl)-Ala-Glu (OBzl)-Asn-OBzl-t 30 percig 15 ml 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk; ezalatt az elegyből kevés kristályos termék válik ki. Az elegyhez 210 ml étert adunk, a kivált szilárd anyagot elkülönítjük, éterrel mossuk, majd metanol és éter elegyléből kristályosítjuk. 2,58 g (75,1%) HcI.H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 148-151 C°, fa] ”= -(3,65° (c=l, DMF). e) 12,6 (40 mmól) Boc-Val-Osu-t 250 ml dimetilformamidban, 2 ml ET3N jelenlétében 4,68 g (40 mmól) H-Val-OH-val kondenzálunk. A reakciót 96 órán át végezzük; ezalatt az elegy enyhén lúgos kémhatásának biztosítására a rendszerhez szükség szerint további mennyiségű Et3N-t adunk. A kivált oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a szűrletet 45 C-on szárazra pároljuk. A maradékot éter és híg (körülbelül 1%-os) vizes kénsavoldat között megoszlatjuk. A szerves fázist elválasztjuk, vízzel háromszor mossuk, vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítjuk és bepároljuk. A habszerű üveg formájában kapott maradékot éter és petroléter elegyéből kristályosítjuk. 12,2 g (96,4%) Boc-Val-Val-OH-t kapunk; op.: 155-158 C°, [a]-^- = +1,10° (c=l, DMF). 40,5 g (128 mmól) Boc-Val-Val-OH-t 60 percig 1,8 liter 4 n tetrahidrofurános sósavoldattal kezelünk. Az oldószert és a sav fölöslegét lepároljuk, és a maradékot éterrel kezelünk. Fehér, amoraf porként 34,5 g HCl.H-Val-Val-OH-t kapunk. Ezt a vegyületet 1 liter dimetilformidban, 54 ml ET3N jelenlétében 24 órán át 55,6 g (128 mmól) Boc-Glu(OBzl)-OSu-val reagáltatjuk. A kivált kevés oldhatatlan anyagot kiszűrjük, és a szőrlet szárazra pároljuk. A kapott olajos maradékot 1,5 liter etilacetátban felvesszük, és az oldatot 5%-os vizes ecetsav-oldattal kétszer, majd vízzel háromszor mossuk. A szerves fázist vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítjuk, majd szárazra pároljuk. Átlátszó, színtelen, nem kristályosodó olajat lápunk. Ezt az anyagot 3,2 liter éterben oldjuk, és az oldathoz 7,5-es pH-érték eléréséig CHA-t (17 ml) adunk. A kivált szilárd sót leszűrjük és metanol és éter elegyéből átkristályosítjuk. 58,9 £ (72,7%) Boc-Glu(OBzl)-Val-Val-OH.CHA-t kapunk: op.: 158-160 C°, [a]jy= 33,41° (c=l, metanol). 1,69 g (2,66 mól) Boc-glu(OBzl)-Val-Val-OH.CHA-t választótölcsérben 40 ml víz és 40 ml etilacetát keverékében szuszpendálunk. A szuszpenzióhoz 4 ml 1 mólos vizes kénsavoldatot adunk, és alaposan összerázzuk. A szilárd anyag feloldódik. A szerves fázist elválasztjuk, vízzel többször mossuk, vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítjuk és bepároljuk. A kapott 1,45 g olajos maradékot, azaz a szabad tripeptidet 15 ml dimetilformamidban, 0,612 g (5,32 mmól) HOSu, 0,3 ml (2,66 mmól) NMM és 0,63 g (3,06 mmól)' DCC jelenlétében 2,58 g (2,61 mmól) HCl.H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzI-el kondenzáljuk. A reakciót 1 órán át 0 C°-on, majd 60 órán át 25 C°-on végezzük; az elegy enyhén lúgos kémhatásának biztosítására a rendszerhez szükség esetén további mennyiségű NMM-t adunk. A kivált oldhatatlan mellékterméket kiszűrjük, és a szűrletet 45 C°-on szárazra pároljuk. A kapott olajos maradékot vizes kezeléssel megszilárdítjuk. A nyers, szilárd terméket 50 ml dimetil-formamidban oldjuk, és 300 ml metanollal kicsapjuk. 2,25 g (58,7%) Boc-Glu OBzl>Val-Val-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl-t kapunk; op.: 277-280 C°, [a] ^ = -12,43° (c=l, DMF). 0,72 g (0,49 mmól), a fentiek szerint kapott terméket 40 ml dimetil-formamid, 30 ml metanol és 2 ml víz elegyében, 0,5 g 5%-os báriumszulfátra felvitt palládiumkatalizátor jelenlétében, 3,4 atmoszféra nyomáson 3 órán át hidrogénezünk. Az elegyet szűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. A maradékot 30 percig 5 ml TFA-val kezeljük, az elegyet bepároljuk, és az így kapott maradékot éterrel többször eldörzsöljük. A képződött fehér, szilárd anyagot 20 ml vízben felvesszük, és az elegyet fagyasztva szárítjuk. A kapott 0,47 súlyú nyers terméket Bio-Rad AG1-X 2 gyantával (erősen bázikus polisztirol-gyanta) töltött és ammóniumacetát-pufferoldattal (ammóniával pH=8,1 -re lúgosított 2%-os vizes ecetsav-odlat) egyensúlyba hozott, 3x32 cm méretű gyantaoszlopra visszük fel. Az oszlopot rendre 200—200 ml 0,025 mólos ammóniumacetát-oldattal (pH=5,5), 0,025 mólos ecetsav-oldattal, 0,05 mólos ecetsav-oldattal, 0,1 mólos ecetsav-oldattal, 0,25 mólos ecetsav-oldattal, 0,5 mólos ecetsav-oldattal, 0,75 mólos ecetsav-oldattal, végül 1 mólos ecetsav-oldattal eluáljuk. Az eluátumot 12 ml-es frakciókba gyűjtjük, és minden egyes frakciót vékonyrétegkromatográfiás elemzésnek vetünk alá. A kívánt terméket tartalmazó frakciókat (azaz a 225—229. frakciót) egyesítjük és kétszer fagyasztva szárítjuk. 0,223 g (48,1%) tiszta H-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH-t kapunk, amely a papír-elektroforézis és vékonyrétegkromatográfiás elemlzés szerint egységes. 2. példa 15 g (39,5 mmól) Boc-Lys(Z)-OH, 5,8 g (50,5 mmól) HOSu, 8,66 g (42 mmól) DCC ás 250 ml tetrahidrofurán elegyét 3 órán át keverjük. A kivált oldhatatlan mellékterméket kiszűrjük, és a szűrletet szárazra pároljuk. A kapott 24,2 g szirupszerű maradékhoz 150 ml izopropanolt és 150 ml petrolétert adunk. 21 g olajos, nem kristályosodó terméket kapunk. Az így kapott nyers Boc-Lys(Z)OSu-t 72 órán át 250 ml dimetil-fromamidban, 5,5 ml ET3N jelenlétében 10,6 g (38 mmól) H-Lys(Z)-OH-val kondenzáljuk. A reakcióelegyet keverjük, és az enyhén lúgos kémhatás biztosítására az elegyhez időnként ET3N-t adunk. Az oldatból kiszűrjük a kis mennyiségű oldhatatlan anyagot, és a szűrletet 45 C-on szárazra pároljuk. A kapott olajos maradékot 1 liter 5%-os vizes ecetsav-oldattal kezeljük. A kivált terméket etilacetáttal kivonjuk. A szerves fázist vízzel mossuk, vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítjuk, bepároljuk, és az olajos maradékot 10 ml DCHA-t tartalmazó 300 ml etilacetáttal elegyítjük. A kapott kristályos sót metanolból és éterből átkristályosítjuk. 22,7 g (72,5%) Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH.DCHA-t kapunk; op.: 160-162 C°, [a]^j-= —2,21° (c=l, metanol). 10 g (12,14 mmól) Boc-Lys(Z)Lys(Z)OH-DCHA-t 1 liter etilacetát és 1 liter 0,1 n vizes kénsavoldat között megoszlatunk. A szerves fázist vízzel háromszor mossuk, vízmentes nátrium-szulfát fölött szárítjuk, és szárazra pároljuk. Az így kapott 7,9 g Boc-Lys(Z)-Lys(Z)OH-t 30 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 4
