183928. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés növények, főleg kultúrnövények termesztett fajtáinak genetikai jellemzésére és minősítésére
1 183 928 2 A találány tárgya eljárás növények, főként kultúrnövények termesztett fajtáinak genetikai jellemzésére és minősítésére, valamint berendezés ezen eljárás megvalósítására. Jelenleg a kultúrnövények termesztett fajtáinak jellemzésére a nemesítők illetve a vetőmagok minősítésével foglalkozó szakemberek gyakorlatilag kizárólag morfológiai és citológiai ismertetőjegyeket használnak, vagyis az egyes növények fajtabéli jellegzetességeit, másrészt homogenitását vagy kevertségét (idegen beporzás esetén) a külső megjelenési formák illetve a kromoszómaállományok összevetésével állapítják meg. Gén-enzim szintű elemzés elvégzésére alkalmas eljárás eddig nem volt ismeretes. A jelenleg alkalmazott módszerek alapvető hátránya az, hogy a morfológiai és citológiai jellemzés elkészítéséhez a vizsgálandó fajta magját el kell vetni, és a növényt fel kell nevelni virágzásig illetve terméshozatalig, hogy a szakember egyáltalán valamilyen adatot nyerhessen. Ez az eljárás időben rendkívül hosszú, egy teljes generációs időt (általában egy évet) igényel, mégpedig megfelelő agrotechnikai feltételek mellett, és végül a levonható következtetések és a kapott paraméterek így is csak közelítő jellegűeknek tekinthetők, ahol nagy szórással kell számolni. Az időveszteség mellett további hátrányt jelent az ismertetett módszer jelentős munka- és költségigénye, valamint az, hogy a vizsgálati eredményeket a nevelési feltételek is erősen befolyásolják. A fentiek mellett még azt a hátrányt is meg kell említeni, hogy bizonyos növények rendkívül kis méretű kromoszómái csak egy rendkívül szűk azonosítási spektrumot biztosítanak. A találmány által megoldandó feladat tehát olyan eljárás kidolgozása növények, elsősorban kultúrnövények termesztett fajtáinak genetikai jellemzésére, amely a vizsgálat elvégzését bármikor, néhány nap vagy adott esetben még rövidebb idő alatt is lehetővé teszi, vagyis nem kötött a vegetációs periódushoz, kísérleti parcellák költséges agrotechnikai előkészítését és gondozását nem igényli és amelynél a nevelési feltételek nem befolyásolják a vizsgálati eredményt, amely így a korábbiaknál sokkal egyértelműbb és megbízhatóbb. A találmány alapja az a felismerés, hogy a kitűzött feladat megfelelően előkészített és feldolgozott mag, embrió, csíranövény közvetlen géntermék-analízissel oldható meg, amelynél a levont következtetések minden mellékhatást kizárva biztosan az adott fajta genetípusára és fenotípusára jellemzőek. A kitűzött feladatot a találmány értelmében olyan eljárással oldottuk meg, amelynek során a vizsgált növényi mintához az oldható fehérjék extrahálására alkalmas, stbíl pH-tartományt biztosító, antioxidánsokat tartalmazó pufferoldatot adagolnak, az így kezelt mintánál homogenizálással és/vagy fagyasztva roncsolással sejtfeltárást végzünk, majd az oldott és nem oldható komponenseket hűtéses centrifugálással különválasztjuk, az oldott fehérjéket tartalmazó folyékony fázist gélelektroforézisnek tesszük ki, amelynek során az oldott fehérjéket töltésük nagysága és molekulasúlyuk szerint gélszerűen különválasztjuk, majd a gélszűrő megfelelő helyeit elfoglaló fehérjéket enzimspecifikus festék(ek)kel és adott esetben fehérjespecifikus festék(ek)kel kezeljük és a kapott színes sávminta alapján vizuálisan elvégezzük a minta genetikai jellemzését és minősítését. A találmány értelmében vizsgálati mintaként a vizsgált növény jellegzetességeinek illetve a vizsgálat céljainak megfelelően magot, embriót) vagy csíranövényt alkalmazunk, mely utóbbit a csíráztatás alatt célszerűen meghatározott megvilágítási programnak illetve szabályozott hőmérsékletnek teszünk ki. A találmány szerinti eljárás megvalósítására alkalmas berendezés lényegében pufferoldat-adagoló készülékből, dörzsmozsárból és/vagy fagyasztva roncsoló sajtoló berendezésből, hűthető preparatív centrifugából, valamint egyenirányító« stabilizált villamos tápegységgel ellátott, gél szűrőt tartalmazó gélelektroforézis berendezésből áll. Csíranövény magról történő csúsztatásához a fenti berendezés célszerűen szabályozott hőmérsékletet és megvilágítást biztosító fitotronnal van kiegészítve. \ találmányt részletesebben kiviteli példa kapcsán illetve a csatolt rajz alapján ismertetjük, amely a találmány szerinti eljárás vázlatos folyamatábráját tünteti fel. Amint az a rajzon is látható, a kiindulási anyagot képező vizsgált növényi minta az adott növénynek megfelelően lehet 1 mag, 2 embrió, az 1 magból 3 csíráztató edényben csíráztatott és 4 fitotronban vagy tenyészszobábsn szabályozott hőmérséklet mellett 5 fénycsövek által szabályozottan megvilágított 6 csíranövény vagy ezen 6 csíranövény 7 hajtása (levele) vagy 8 gyökere. A csíráztatásnál a szabályozott hőmérséklet gyakorlatilag szobahőmérsékletet, vagyis 25 ± 2 °C-ot jelent, míg a megvilágítás célszerűen vörös fényű, 1000—10 000 lux fényerősségű fénycsövekkel történik, előnyösen 12 óra sötétből és 12 óra megvilágításból álló ciklusokban. A v zsgált mintát sejtfeltárás céljából 9 dörzsmozsárban 0—5 DC-on szétdörzsölve homogenizáljuk és/vagy 11 sajtoló berendezésben —40 és —100 °C között, célszerűen --60 °C-on és 15—35 MPa közötti, célszerűen 27 MPa nyomáson (amelyet adott esetben 12 légkompresszor biztosít) fagyasztva roncsoljuk. A 11 sajtoló berendezésben szárazjéggel lefagyasztott mintát egy 2 mm 0 nyíláson szilárd állapotban, nagy nyomásai átsajtolva a sejteket úgy lehet elroncsolni, hogy a vizsgálandó komponenselet nem éri károsodás. Közvetlenül a sejtfeltárás előtt a vizsgált mintához 10 pufferoldat-adagolóből az oldható fehérjék extrahálására alkalmas, stabil, célszerűen 5 és 8 pH-érték közötti pH- tartományt biztosító, antioxidánsokat tartalmazó pufferoldatot adunk. A sejtfeltárás után az oldott és nem oldhataó komponenseket hűthető preparatív 13 centrifugában választjuk szét, célszerűen 20 percig tartó, 0—5 °C-on végzett centrifugálással. Az így kapott folyékony fázist 14 gélelektroforízis berendezésbe visszük, amely gélszűrőt tartalmazó 15 elektroforízis cellából és egyenirányító«, stabilizált 16 villamos tápegységből áll. A 14 gélelektroforízis berendezésben a gélszűrő megválasztásától függően a fehérjéket elektromos erőtérben töltésük nagysága és molekulasúlyuk alapján szétválaszthatjuk. Általában gélszűrőként poliacrilamidot alkalmazunk, de gélelektrofókuszáláshoz, vgyis a fehérjék csak töltés szerinti szétválasztásához pH-gradienst létrehozó anyaggal töltött gélszűrőt használunk. A gélszűrőn szétvált fehérjecsoportok, amelyeket a 17 hivatkozási számmal jelölt rész szimbolizál, színtelenek. Láthatóvá tételüknek két módja van: egyrészt a fehérjespecifikus festékekkel való kezelés, amit 19 hivatkozási számmal jelöltünk, másrészt a 18 hivatkozási számmal jelölt enzimspecifikus festés. A fehérjespecifi5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
