183928. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és berendezés növények, főleg kultúrnövények termesztett fajtáinak genetikai jellemzésére és minősítésére
1 2 183 928 kus festést elsősorban az enzimspecifikus festés kiegészítéseképpen alkalmazzuk, az enzimspecifikus festés eredményeinek alátámasztására vagy kiegészítésére. Réztartalmú vagy ezüsttartalmú festékkel gyakorlatilag minden fehérje festhető. A fehérjék többsége enzimatikus funkcióval bír. Ha természetes vagy mesterséges szubsztrátjukat hozzáadjuk, szemmel láthatóan is kifejtik aktivitásukat, ezen alapszik az enzimspecifikus festés művelete. Az enzimműködést a reakciótermékek színreakcióival lehet a gélszűrőn levő enzimfehérje helyén kimutatni. A minta genetikai jellemzését a 20 helyen a létrejövő színes sávminta kiértékelésével tudjuk elvégezni. A fehérjék (enzimek) molekuláris sajátságai a vizsgált minta genetikai sajátságaival korrelációban vannak. Az eljárással létrehozott színes sávmjnták jellemlzőek fajra, fajtára, termesztett vonalakra egyaránt. Hibridekben az összetevő, fájták genomjának (vagyis egy adott növényi sejt génjei összességének) jelenléte a (szülőktől) már ismert sávminták alapján kimutatható. A nem egységes genetikai háttér a fehérje összetevők heterogenitásában (a sávminták eltéréseiben) tükröződik. Előnyös sajátságok átadása adott módon megjelölt fehérjék (enzimek) jelenlétével (vagyis azokra tipikus sávok jelenlétével) generációról generációra nyomon követhető. Hasonló módon a fajtaleromlás genetikai háttere vagy termesztett vonalak genetikai tisztasága is kimutatható. A találmány szerinti eljárással a minták száma sokszorosa lehet annak, mint ami kísérleti parcellákban nevelt növények azalíziseinél lehetséges. így a találmány különösen alkalmas vetőmagok és szaporítóanyagok minősítésére, mivel a pontos genotípus-információ folyamatos és biztos előrejelzés lehetőségét adja meg a vetőmagforgalmazó és -vásárló számára egyaránt. A találmány gyakorlati alkalmazására nézzünk egy konkrét példát: A feladat hibrid napraforgó vetőmag fajtaazonosságának megállapítása izoenzim vizsgálat alapján illetve az illegitim beporzás valószínűségének becslése. A vizsgálatokat száraz magvakból és csíranövény levélből kiindulva végeztük, amelyeket a már leírt módon pufferoldat hozzáadása mellett dörzsmozsárban eldörzsöltük, centrifugáltuk és az így nyert fehérje kivonatokat vetettük alá gélelektroforízisnek, illetve gélelektrofókuszálásnak. Ezen belül elvégeztük 1. a dehidrogenáz enzimek gélelektroforízis utáni specifikus festését; 2. a dehidrogenáz izoenzimek gélelektrofókuszálás utáni specifikus festését; 3. a peroxidáz izoenzimek gélelektroforízis utáni specifikus festését. A színes sávminták alapján elvégeztük az összehasonlító értékelést a szülői vonalak, a biztosan izolált illetve a kérdéses hibrid, valamint a feltételezett beporzó között. A sávminták összehasonlításából, illetve kiértékeléséből levonható következtetés a következő volt: 1. Az idegen beporzásból adódó heterogenitás 4,2%. (A szabványban megengedett heterogenitás 10%). 2. Az alkalmazott izolációs távolság feleslegesen nagy és lényegesen kisebb távolság is kielégítő tisztaságot biztosít. SZABADALMI IGÉNYPONTOK I. Eljárás növények, főként kultúrnövények termesztett fajtáinak genetikai jellemzésére és minősítésére, azzal 5 jellemezve, hogy a vizsgált növényi mintához az oldható fehérjék extrahálására alkalmas, stbil pH-tartományt biztosító, antioxidánsokat tartalmazó pufferoldatot adagolunk, az így kezelt mintánál homogenizálással és/vagy fagyasztva roncsolással sejtfeltárást végzünk, majd az 10 oldott és nem oldható komponenseket hűtéses centrifugálással különválasztjuk, az oldott fehérjéket tartalmazó folyékony fázist gélelektroforízisnek tesszük ki, amelynek során az oldott fehérjéket töltésük nagysága és molekulasúlyuk szerint gélszűrőben különválasztjuk, majd a gél-15 szűrő megfelelő helyeit elfoglaló fehérjéket enzimspecifikus festék(ek)kel és adott esetben fehérjespecifikus festék(ek)kel kezeljük és a kapott színes sávminta alapján vizuálisan elvégezzük a minta genetikai jellemzését és minősítését. 20 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy vizsgálati mintaként növényi magot alkalmazunkj. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy vizsgálati mintaként növényi 25 embriót alkalmazunk. 4. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy vizsgálati mintaként növényi magból szabályozott megvilágítás és hőmérséklet mellett csíráztatott csíranövényt, vagy ennek hajtását illetve gyö-30 kerét alkalmazzuk. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a csíráztatást szobahőmérsékleten, vörös fényű, 1000—10 000 lux fényerősségű fénycsövek adott megvilágítási ritmusú alkalmazása mellett, cél-35 szerűen fitotronban végezzük. 6. az 1.—5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a pufferoldat pH-tartományát 5 és 8 pH közé állítjuk be. 7. Az 1.—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a homogenizálást a vizsgált minta dörzsmozsárban való, 0—5 °C-on történő eldörzsölésével végezzük. 8. az 1.—6. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a fogyasztva 45 roncsolást —40 és —100 °C közötti, célszerűen —60 °C hőmérsékleten és 15—35 MPa, célszerűen 27 MPa nyomással működő sajtoló berendezésben végezzük. 9. Az 1—8. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a sejtfeltárás ® után a pufferoldattal kezelt mintát 20 percig, 0—5 °C-on centrifiigáljuk. 10. Az 1.—9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a élelektroforízis során poliacrilamid gélszűrőt alkalmazunk. II. Az 1.—9. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a gélelektrofókuszálás során pH-radienst létrehozó anyagú gélszűrőt alkalmazunk. gQ 12. Az 1.—11. igénypontok bármelyike szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a fehérjék enzimspecifikus festésére a fehérjékhez ezek aktivitását megjelenítő természetes vagy mesterséges szubsztrátot adunk. 3
