183680. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új indolinonok előállítására
1 183 680 2 Számos betegség esetén akkor is megszűnhetnek az alvadási folyamatok és összetömörülhetnek a trombociták, ha az érrendszer sértetlen. Ismert, hoy a véralvasztó rendszer kumarinokkal vagy heparinnal gyengíthető és ismert véralvadási vizsgálatokkal könnyen meghatározható, amelyek a készítmény hatására meghosszabbodást mutatnak (plazmarekalcifidő, Quick-idő, trombin-idő stb.). Minthogy sérülés esetén az első gyors vérzéscsillapítást a tronibociták végzik, standard sérülés létrehozásakor a trombociták funkciója a vérzési idő meghatározásának a segítségével jól meghatározható. A normális vérzési idő emberek esetében körülbelül 1—3 perc, ez azonban teljesítőképes és megfelelő mennyiségben jelenlevő trombocitákat feltételez. Normális trombocitaszám esetén a meghosszabbodott vérzési idő tehát a trombociták funkciózavarára mutat. Ezt például néhány veleszületett trombocitafunkciózavar esetén tapasztaljuk. Másrészt, ha a trombocitáknak azt a hajlamát akarjuk gyógyszerekkel meggátolni, hogy spontán összetömörüljenek és ezáltal az artériás rendszerben érelzáródásokat okozzanak, a trombocitákra ható eredményes terápiával meg kell hosszabbítani a vérzési időt. Egy trombocitákra ható anyagtól tehát meghosszabbodott vérzési időt és — minthogy a plazmatikus véralvasztó rendszert nem érinti — normál véralvadási időt várunk. (Irodalom: Keidel, W. D.: Kurzgefaßtes Lehrbuch der Physiologie, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1967., 31. oldal). A vérzési idő meghatározása céljából a vizsgálandó anyagokat éber állapotban levő egereknek adjuk be orálisan, 10 mg/kg adagban. Egy óra múlva mindegyik állat farkának hegyéből körülbelül 0,5 mm-nyi darabot levágunk, és a kilépő vért 30 másodperces időközökben szűrőpapírral óvatosan leitatjuk. Az így kapott vércseppek száma adja meg a vérzési idő mértékét (minden kísérlethez 5 állatot használunk). Az alábbi számadatok a kontroll állatokhoz viszonyított százalékos meghosszabbodást jelentik. , Vérzési idő meghosszabbodása °/o-ban Hatóanyag . , .. I óra mnlva B 59 D >249 E >198 F >232 G 154 H 149 I >214 K >285 L 102 M 140 N >254 O 127 P 114 Q >174 R >242 S 104 2. PDE-gátlás A különböző forrásokból származó foszfodiészterázok (PDE), így a vérlemezkékből származó foszfodiészterázok is, a cAMP-t AMP-vé hidrolizálják. Ezt a hidrolízist gátolják a koncentrációtól függően a PDE-gátlók. 5 Módszer Foszfodiészterázokként 10000 g-vel centrifugált olyan humán vérlemezkék felülúszóját használjuk, amelyeket desztillált vízzel megfagyasztottuk és újra felengedtettünk. 0,3 ml, 0,1 mol/liter triszhidroxi-amino-metánt (pH = 7,4), 3 mmol/liter magnézium-kloridot, I mmol/liter AMP-t, 1/imol/liter 3H—cAMP-t (specifikus aktivitás: körülbelül 10 MBq/umol), PDE-t valamint a vizsgálandó anyagot, illetve a kontrollok esetén vizet tartalmazó elegyet 15 percen keresztül 37 °C-on inkubálunk. Az inkubálást 0,5 ml cink-szulfát-oldat (0,266 mol/liter) és 0,5 ml bárium-hidroxid-oldat (0,226 mol/liter) beadagolásával leállítjuk, a csapadékot •-0 centrifugáljuk és a felülúszóban meghatározzuk a reagálatlan 3H—cAMP maradék aktivitását. A vizsgálandó anyagot tartalmazó próbákat összehasonlítjuk a kontroll próbákkal és minden hatóanyag esetén kiszámítjuk az 50%-os gátló hatás (ICjo) eléréséhez :>5 szükséges hatóanyagkoncentrációt. Halóanyag IC50 ú'inol/liter) A 2,50 30 B 0,30 C 2,50 D 0,027 E 0,54 F 0,24 35 G 0,07 H 0,059 I 0,50 K 0,27 L 0,24 4.0 N 0,11 O 0,11 P 0,36 Q 0,38 R 0,24 VG S 0,058 3. Akut toxicitás 00 5—5 egérből álló csoportoknak orálisan beadtuk a vizsgálandó anyagok 250 mg/kg, illetve 1000 mg/kg mennyiségét, semmilyen toxikus mellékhatást nem figyeltünk meg (megfigyelési idő: 14 nap). b-5 Hatóanyag Toxicitás A 250 mg/kg p.o. (5 állatból 0 pusztult el) B 1000 mg/kg p.o. (6 állatból 0 pusztult el) C 1000 mg/kg p.o. (6 állatból 0 pusztult el) 50 D 1000 mg/kg p.o. (6 állatból 0 pusztult el) E 1000 mg/kg p.o. (6 állatból 0 pusztult el) F 1000 mg/kg p.o. (6 állatból 0 pusztult el) G 1000 mg/kg p.o. (6 állatból 0 pusztult el) H 1000 mg/kg p.o. (6 állatból 0 pusztult el) 65 I 1000 mg/kg p.o. (6 állatból 0 pusztult el) 4
