183636. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új anorexigén hatású peptidek előállítására
1 183 636 2 enil)-alanin nem igényelnek védőcsoportot az a-aminocsoportot kivéve. A reakcióelegyhez hozzáadunk lényegében ekvimoláris mennyiségben egy kondenzálószert, például diciklohexil-karbodiimidet vagy előnyösen diizopropil-karbodiimidet. A reakcióelegyet 2 órán át szobahőmérsékleten (22-25 °C) keverjük, majd ezután az aminosavval kapcsolt gyantát háromszor metilén-kloriddal mossuk. Ezt követően a kapcsolt aminosav védőcsoportját 33%-os metilén-kloridos trifluor-ecetsav-oldattal végzett kétszeres kezelés útján eltávolítjuk. Ezután a korábbiakban említett mosóciklus c) — h) műveleteit végrehajtjuk. Az előző bekezdésben ismertetett műveleteket ezután megismételjük egy megfelelően védett olyan aminosavval, amely az A csoportnak felel meg, ha C aminosavat jelent. Az ilyen módon előállított védett peptidgyantát háromszor metilén-kloriddal és azután háromszor metanollal mossuk, majd csökkentett nyomáson szántjuk. Gyakorlatilag az elméleti hozam (96% vagy ennél több) érhető el. C helyén -NHR1 csoportot vagy aminosav-monoalkilamidot hordozó (I) általános képletű peptid előállítására a védett peptidgyantát 0 °C-on egy megfelelő, az alkilrészében 1 — 3 szénatomot tartalmazó alkil-aminban szuszpendáljuk és több órán át keverjük. A fölöslegben levő alkil-amint ezután szobahőmérsékleten ledesztilláljuk, míg a lehasított peptidet a gyantából dimetil-formamiddal kimossuk. A védett peptidet ezután etil-acetát hozzáadása útján kicsapjuk, majd kiszűrjük. így tehát a védett peptidet kapjuk, amelyben C jelentése -NHR1 csoport vagy egy amino-monoalkil-amid rész. Az előzőekben ismertetett módon előállított pepiidről a védőcsoportot ö °C-on hidrogén-fluorid és anizol keverékével 15—60 percen át, előnyösen 30 percen át végzett kezeléssel hasítjuk le. A hidrogén-fluoridot csökkentett nyomáson, illetve az anizolt dietil-éteres mosással távolítjuk el. A C helyén egy szabad aminosavat tartalmazó (I) általános képletű peptidek előállítása céljából a megfelelő védett peptidgyantát az, előzőekben ismertetett módon hidrogén-fluorid és anizol keverékével kezeljük. E kezeléssel egyidejűleg történik a hordozóról való lehasítás és a védőcsoportok eltávolítása. A következőkben az (I) általános képletű peptidekkel végzett biológiai vizsgálatok konkrét eredményeit isn^rtetjük. Az (I) általános képletű peptideknek a táplálékfelvételre és az étvágyra kifejtett hatását, illetve étvágyszabályozó hatását egerekkel és patkányokkal végzett etetési kísérletekben lényegében a Trygstad és munkatársai, valamint Reichelt és munkatársai által kidolgozott, korábban már referált módszerekkel vizsgáljuk. Szabályos időközökben a napi tápfogyasztást 0,1 g-os pontossággal és & testsúlyt 1 g-os pontossággal megállapítjuk. Bizonyos időpontokban megállapítunk más adatokat is, így az oxigénfogyasztást, testhőmérsékletet, a vér glükózés/vagy inzulintükrét és kvantitatív aminogrammot. Az (I) általános képletű peptideknek a gyomorés/vagy hasnyálmirigykiválasztásra kifejtett hatását patkányokon vagy előnyösen kutyákon — amelyek el vannak látva nyelőcső-, gyomor- és hasnyálmirigy-fisztulákkal — Babkin, Ölbe vagy Liebling és munkatársai korábban már referált módszereivel határozzuk meg. Kutyáknál a látszólagos táplálás kifejezetten növeli a savkiválasztást, mégpedig ez a kiválasztás a maximális kiválasztás 82%-ának felel meg. A maximális kiválasztás 320 üg/kg/ óra/13,55 ± 1,8 milliekvivalens/15perc/ hisztamin beadásával érhető el. Ugyanakkor a vérszérumban a gasztrinszint szignifikáns módon emelkedik, mégpedig 73 ± 10 pg/ml értékre 32 ± 5 pg/ml alapértékről. A látszólagos táplálás ugyanakkor kifejezetten növeli a hasnyálmirigy fehéijekiválasztását, mégpedig ez a kiválasztás a maximális kiválasztás 71%-ának felel meg. A maximális kiválasztás 0,5 Mg/kg/óra/650 ± 86 mg/Í5perc/ caerulein beadásával érhető el. Az (I) általános képletű peptidek 25—50 Ug/kg/óra dózisokban intravénás infúzió útján a látszólagos etetést megelőzően 30 perccel és a látszólagos etetéskor beadva a maximális savkiválasztást mintegy 34%-kal (anélkül, hogy a vérszérum gasztrinszintjét lényegesen megváltoztatnák) és a maximális hasnyálmirigy-fehérjekiválasztást mintegy 38%-kal csökkentik. Gyomorfisztulával és Heidenhain-táskával ellátott kutyáknál májextraktum-táp gasztrikus etetése a savkiválasztás kifejezett növekedéséhez vezet, mégpedig a savkiválasztás a maximális kiválasztás (ami a kutyánál a gyomorfisztulán át hisztamin beadásával váltható ki) 90%-ának, illetve Heidenhain-táskával ellátott kutyáknál a 35%-ának felel meg, míg ugyanakkor a szérumban a gasztrinszint kifejezetten szignifikáns módon az eredeti 29±5 pg/ml értékről több, mint a kétszeresére, 76±12 pg/ml értékre nő. Az (I) általános képletű peptideket a táplálék beadása során 50 Mg/kg/óra dózisban intravénás infúzió útján a kísérleti állat szervezetébejuttatva megállapítható, hogy gyomorfisztulával ellátott kutyáknál a májextrakt mint táplálék adagolása útján megindított savkiválasztás 35%-kal csökken, míg Heidenhaintáskákkal ellátott kutyáknál 41%-kal csökken, anélkül, hogy a vérszérum gasztrinszintjében lényeges változás lenne észlelhető. Az (I) általános képletű peptidek gátolják a táplálás által kiváltott inzulin- és gasztrinszintnövekedést is. Hasnyálmirigy-fisztulával ellátott kutyáknál egy normális táplálás a hasnyálmirigy általi HCO3 -kiválasztást a 3 KU/kg/óra szekretin által kiváltható maximális érték 80%-ára, míg fehéijekiválasztást a 0,5 Mg/kg/óra caerulein által kiváltható maximális érték 93%-ára növeli. A korábbiakban ismertetett módon beadott (I) általános képletű peptidek a táplálás második órájában a HCOjkiválasztást 35%-kal és a fehéije(enzim)-kiválasztást 46%-kai csökkentik, anélkül, hogy hányingert vagy más mellékhatást okoznának. A fentiekben ismertetett eredmények világosan mutatják, hogy az (I) általános képletű peptidek a gyomor- és a hasnyálmirigykiválasztás agy-, gyomor- és bélszakaszát gátolják, feltételezhetően azon neuro-hormonális mechanizmusok elnyomása útján, amelyek ezekért a kiválasztásokért felelősek. Az agyi fázis esetében a gyomorkiválasztás idegi, fizikai vagy étvágy szakaszáról van szó, melyek gátlása az (I) általános képletű peptidek étvágycsökkentő és anorexigén hatásában jelenik meg. A találmányt közelebbről a következő kiviteli példákkal kívánjuk megvilágítani. 1. példa D - Prioglutamil - L - hisztidil -(tozil) - glicil-OCHTgyan ta (D-H-(pyro)-Glu-His)N«n-R3(-Gly-0-CH2-gyanta; R3 = Tos) Automatikus peptidszintetizáló berendezés (a Beckmann-cég 990-es modellje) reakcióedényébe beadagolunk 2,70 g (1,00 millimól glicint tartalmazó) Boc-Gly-0-CH2-gyanta képletű Boc-glicin-gyantát. A berendezés a következő mosóprogramra van beprogramozva: 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
