183636. lajstromszámú szabadalom • Eljárás új anorexigén hatású peptidek előállítására
1 183 636 2 (a) metilén-klorid, (b) 33%-os metflën-kloridos trifluor-ecetsav-oldat (kétszeres kezelés; 1, illetve 25 percen át), (c) metilén-klorid, (d) etanol, (e) kloroform, (0 10%-os kloroformos trie til-amin-oldat (kétszeres kezelés; mindkétszer 2 percen át), (g) kloroform, és (h) metilén-klorid. A mosott gyantát azután 3,0 millimól terc-butoxikarbonil-tozil-hisztidinnel keverjük metilén-kloridban, a reakcióelegyhez, 3,0 millimól diizopropil-karbodiimidet adva. A reakcióelegyet szobahőmérsékleten 1 órán át keverjük, majd a kapott peptidgyantát az előzőekben ismertetett mosóprogram (a) — (h) lépéseinek vetjük alá. Ezt követően ugyanilyen módon a peptidgyantához 3,0 millimól D-piroglutaminsavat kapcsolunk, ezáltal a cím szerinti terméket kapva. A kész tripeptidgyantát háromszor metilén-kloriddal, majd háromszor metanollal mossuk. Szárítás után 2,89 g anyagot kapunk. A kiindulási anyagként használt giicin-gyantát kereskedelmi forgalomban levő klór-metilezett gyantából [1%-os térhálósítású; a Bio Rád Laboratories (Richmond, Kalifornia állam) amerikai cég terméke] állítjuk elő. 2. példa D- Pirogjutamil -L-hisztidil -giicin Az 1. példában kapott 2,89 g védett tripeptidgyantát 0 °C-on 45 percen át 40 ml hidrogén-fluorid és 10 ml anizol elegyében szuszpendáljuk, majd a hidrogén-fluoridot vízmentes nitrogéngáz átáramdtatása útján elpárologtatjuk. Az anizolt dietil-éterrel végzett mosás útján távdítjuk el. A nyers pepiidet Sephadex G 15 gyantával („fine” jelzésű; kémiailag modifikált, térhálósított dextrán) töltött, 2,5X95 cm méretű oszlopon gélszüréssel tisztítjuk. A tiszta terméket tartalmazó frakciókat (azeluátum 320. és 340. ml-e közötti frakciót) liofilizáljuk. Így 320 mg mennyiségben színtelen peyhes por alakjában D-H-/pyro/-Glu-His-Gly-OH-t kapunk. Szilikagélből készült lemezeken négy különféle oldószerrel végrehajtott vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokban a termék pepiid homogénnek bizonyul. A vizsgálat során mindig 20-30 jug-os mintákat viszünk fel folt alakjában. Az előhívás klórgázas kezelés, majd keményítőreagenssel végzett bepermetezés útján történik. A következő Rf-értékeket kapjuk. 1-butanol : ecetsav : víz 4:1:5 térfogatarányú elegyének felső fázisa = 0,08; etil-acetát : piridin : ecetsav; víz 5; 5:1:3 térfogatarányú elegye = 0,28; 1- butanol : ecetsav : víz : etil-acetát 1 ; 1:1:1 térfogatarányú elegye = 0,18; és 2- propanol : 1 mólos ecetsav-oldat 2:1 arányú elegye = 0,20. Aminosav-elemzésnél a következő értékeket kapjuk: Glu = 1,03, Gly = 1,00 és His= 0,99. 3 3. példa 3 súlyrész D-piroglutamil-L-hisztidil-glicint feloldunk 1000 rész desztillált, lázkeltőktől mentes vízben, majd a kapott oldathoz izotóniás oldat előállításához szükséges mennyiségű nátrium-kioridot adagolunk. Ezután az oldatot autoklávban sterilizáljuk, majd ampullákba töltjük. Gyógyászati felhasználásra alkalmas infúziós oldatot kapunk. 4. példa 12 súly rész D-piroglutamil-L-hisztidfl-giicin, 500 súlyrész fehér magnézium-karbonát és 20 súlyrész magnézium-sztearát keverékét durva darabokká préseljük. A darabokat granuláljuk, majd 2,38 mm lyukméretű szitán átbocsátjuk és sajtoljuk. Az így kapott tabletták orális beadásra alkalmasak. 5. példa 12 súlyrész D-piroglutamil-L-hisztidü-glicin és 500 súlyrész fehér magnézium-karbonát keverékét 2 rész nátrium-dioktil-szulfoszukdnát elegendő mennyiségű metanollal készült oldatával granuláljuk, majd a granulátumot átbocsátjuk 1,68 mm lyukméretű szitán és 50- 55 °C-on szárítjuk. Ezt követően a granulátumot mégegyszer átbocsátjuk az említett lyukméretű szitán. 8 súlyrész magnézium-sztearát adagolását követően a keveréket tablettákká sajtoljuk. Ezek orális beadásra alkalmasak. 6. példa 24 súlyrész D-píroglutamil-L-hisztidil-glicin, 476 súlyrész laktóz, 94 súlyrész kukoricakeményítő és 3 súly rész magnézium-sztearát keverékét durva darabokká préseljük, majd granulátummá aprítjuk és 2,38 mm lyukméretű szitán átbocsátjuk. A granulátumot ezután 15 súlyrész sellak és 3 súlyrész ricinusolaj 800 súlyrész etanollal készült oldatából kielégítő mennyiséggel bevonjuk. 3 súlyrész magnézium-sztearát adagolását követően a granulátumot tablettákká sajtoljuk. Ezek orális beadásra alkalmasak. 7. példa Golyósmalomban 24 súlyrész D-piroglutamil-L-hisztidil-glicinnel összekeverünk 576 súlyrész laktózt, majd a kapott keveréket zselatinkapszulákba töltjük. így orális beadásra alkalmas kapszulákat kapunk. 8. példa L-piroglutamil-L-3’-metil-hisztidil-glicil-0-CH2-gyanta Az 1. példában ismertetett módon eljárva, de terc-butoxi-karbonü-tozil-hisztidin helyett terc-butoxi-karbonil-3’-metü-hísztidint és D-piroglutaminsav helyett L-piroglutaminsavat használva 2,90 g mennyiségben a cím szerinti terméket kapjuk. 9. példa L-Piroglutamil - L- 3- metil -hisztidil -giicin A 2. példában ismertetett módon eljárva, de a 8. példa szerint előállított, 2,90 g mennyiségű terméket használva kiindulási anyagként, továbbá az eluátum 280. és 320. ml-e közötti frakciót elkülönítve 251 mg mennyiségben színtelen pelyhes por alakjában a cím szerinti vegyületet kapjuk. Szilikagélből készült lemezeken négy különféle oldószerrendszerrel végrehajtott vékonyrétegkromatográfiás vizsgálatokban a termék peptid homogénnek bizonyul. A vizsgálat során mindig 20-30 Mg-os mintákat viszünk fel folt alakjában. Az előhívás klórgázas kezelés, majd keményítőreagenssel végzett bepermetezés útján történik. A következő Rf-értékeket kapjuk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
