183630. lajstromszámú szabadalom • Eljárás glukozon előállítására
1 183 630 2 terméket, fruktózt szolgáltat, amely viszonylag szennyezésmentes és mivel a szennyezések csupán a természetes glukózforrásokból, pl. keményítőkből - így kukoricakeményítőből — származnak, nem befolyásolják a termék élelmiszerminőségét. A glukóz-2-oxidáz enzim vizes enzim-oldat, rögzített enzim, rögzített enzimek vagy micélium vagy szabad sejtek vagy micélium alakjában alkalmazható. Leggyakrabban, mivel az enzim intracelluláris, a kiválasztott mikroorganizmusok sejtjeit vagy micéliumát úgy alkalmazzuk, hogy egyszerűen szuszpendáljuk a reakcióelegyben. Enzim-promotorok és enzimvédő anyagok ugyancsak jelen lehetnek. Mind például az említett közlemény - Folia Microbiol. 23, 292-298, 1978 - leírja, fluorid ion jelenléte elősegíti a glukóz 0. mucida-val végzett enzimes oxidációját. Enzimvédő anyagok, például Co, Mn és Mg sók ugyancsak alkalmazhatók. Az enzimes oxidációs reakciót addig folytatjuk, amíg lényegében teljessé válik; ez oly módon követhető,hogy az elegy bői mintákat veszünk a glukóz-tartalom meghatározására, vagy a glukózon kolorimetriás meghatározására, vagy a hidrogén-peroxid meghatározására. Rendszerint kb. 24-48 órás reakcióidők elégségesek az enzim potenciáljától vagy aktivitásától függően. A találmány szerinti eljárásban alkalmazott glukóz- 2-oxidáz előállítására számos mikroorganizmus alkalmazható. Az irodalomban erre a célra például a következő mikroorganizmusokat írják le: I. Aspergillus parasiticus (Biochem. J. 31, 1033, 1937) II. Iridophycus flaccidum (Science 124,171,1956) III. Oudemansiella mucida (Folia Microbiol. 13, 334, 1968; 23, 292-298, 1978) IV. Gluconobacter roseus (J. Gen. Appl. Microbiol. 1, 152,1955) V. Polyporus obtusus (Biochem. Biophys. Acta 167, 501, 1968) VI. Corticium caeruleum (Phytochemistry 1977, vol. 16, 1895-7). Az enzimes oxidációs reakció hőmérséklete nem kritikus. A reakció szobahőmérsékleten vagy valamivel szobahőmérséklet fölött is végezhető, ahol az alkalmazott enzim-rendszer megfelelő hő stabilitással rendelkezik. Közelebbről: előnyösen 50 °C-on vagy ennél magasabb hőmérsékleten dolgozhatunk hőstabil enzim-rendszerekkel; ebben a tartományban minimálisra csökken a reakciód egy bakteriális fertőződésének veszélye. Egy másik megoldás szerint az enzimes reakcióelegy antibakteriális anyagokat tartalmazhat a baktériumok nagymértékű elszaporodásának megakadályozására. A reakcióelegy természetesen az említett enzimeken kívül nem tartalmazhat nagyobb mennyiségű hidrogénperoxid-redukálószert annak érdekében, hogy a találmány szerinti eljárás előnyös eredményeit elérhessük, így a rendszernek lényegében H202 redukáló anyagoktól mentesnek, azaz nem-redukáló rendszernek kell lennie, eltekintve a meghatározott célból hozzáadott enzimektől vagy a platinától. A hidrogén-peroxid eltávolítására használt redukáló enzim forrása bármely peroxidáz vagy kataláz forrás lehet; ez előnyösen olyan élelmiszer-forrás, amely összeegyeztethető a végtermék, a fruktóz kívánt élelmiszerminőségével. Így élesztő, tej, tojás, retek és hasonló források alkalmazását részesítjük rendszerint előnyben függetlenül attól, hogy az enzimet mint ilyet vagy rögzített állapotban alkalmazzuk. A glukózon fruktózzá való redukálását ismert eljárásokkal hajtjuk végre, ideértve a kémiai redukciót - például cinkkel és ecetsawal -, valamint a szokásos fém katalizátorok alkalmazásával végzett katalitikus hidrogénezést. Ezek közül a kitüntetett fém katalizátor a Raney Ni, mivel alkalmazása összeegyezhethető a fruktóz kívánt minőségével, azaz ez a katalizátor nem hagy vissza maradékot vagy szennyező anyagokat. A szokásosan alkalmazott eljárásban a glukozont nagyobb nyomáson és hőmérsékleten hidrogénezzük a kiválasztott fém katalizátor felett, amíg a kívánt hidrogénezési fokot el nem értük. A nyomás 100 -700 atmoszféra vagy még ennél is nagyobb lehet, míg a hőmérséklet legfeljebb kb. 200 °C-ig terjedhet. Előnyös a 100-150 °C tartomány és a kb. 500 atmoszféra nyomás. A találmányt a következő példával szemléltetjük. 1. példa O. mucida micéliumot tenyésztünk a 175 897 sz. csehszlovák szabadalmi leírás 1. példája szerint és 15 g szárazanyagnak megfelelő micélium-mennyiséget 3 liter 2,5%-os glukóz oldatban - amely NaF-ra nézve 0,05M töménységű - szuszpendálunk egy 10 literes reaktorban. A glukóz oldatban DEAE cellulózon rögzített kataláz enzimet (Cellex-D, gyártja a Bio-Rad Laboratories) szuszpendálunk. A szuszpenziót 25 °C-on keverjük és oxigénnel fúvatjuk át. 24 óra elteltével a micéliumot és a rögzített enzimet eltávolítjuk az oldatból és a kapott tiszta oldatot Raney Ni fölött, 500 atmoszféra hidrogéngáz-nyomáson és 100 °C-on hidrogénezzük. A vizes elegyből kiszűrjük a katalizátort, a tiszta oldatot szénnel színtelenítjük, ioncserélővel (anion- és kationcserélő) ionmentesítjük és csökkentett nyomáson fruktóz szörppé töményítjük be. Egy másik megoldás szerint a vizes oldatot betöményítjük és a fruktózt hagyjuk kristályosodni. Az akár szörp, akár kristályos termék alakjában kapott fruktóz élelmiszer minőségű. Lényegében ugyanezeket az eredményeket kapjuk, ha az O. mucida-t a következő mikroorganizmusokkal helyettesítjük: Polyporus obtusus Radulum casearium Lenzites Trabea Irpex flanus Polyporus versicolor Pellicularia fflamentosa Armillaria mellea Schizophyleum commune Corticium caeruleum 2. példa Az 1. példa szerinti eljárást ismételjük meg oly módon, hogy a rögzített kataláz enzimet több, platinával bevont fémráccsal helyettesítjük; lényegében azonos eredményeket kapunk. 3. példa Az 1. példa szerinti eljárást ismételjük meg oly módon, hogy a rögzített enzim helyett vizes kataláz enzim oldatot használunk; lényegében azonos eredményeket kapunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
