183549. lajstromszámú szabadalom • Eljárás metanobaktériumokkal végzett B-12 vitamin fermantáció fermentlevének elválasztására
sőrélesztőhidrolizátum 2 ml (szárazanyagtartalom : 20—30%) ipari máj extraktum 2 ml (szárazanyagtartalom : 20—30%) ammónium-lignoszulfonát 0,6 g (Totanin—B) ammóniumhidrokarbonát 3 g ammóniumhidroxid 24%-os 1 ml diammóniumhidrogénfoszfát 0,2 g magnéziumklorid 0,1 g kobaltklorid 0,01 g o-xilidin 0,02 g borostánykősav 0,006 g glicin 0,006 g 5,6-dimetilbenzimidiazol 0,006 g metanol 50,0 ml A fermentort ismét intenzíven átkeverjük és az ilymódon végzett félfolyamatos fermentációt 7—10 napon át folytatjuk. Ezt követően a törzsfenntartó félfolyamatos fermentációnál csak annyi változtatást végzünk, hogy a fentiekben megadott tápanyagokon kívül még 1 g ammóniumszulfátot is adagolunk. Ezzel szemben a 7—10. naptól a törzsfenntartó fermentorból elvett 1 liter fermentlé az ún. termelő fermentlé, amely kezdeti Bu-vitamin tartalma 14,5 mg/1. Az 1 liter termelő fermentléhez, amelyet 1,5 literes üvegfermentorban helyezünk el, utófermentálásnak (termelő fermentálásnak) vetjük alá oly módon, hogy 24 óránként az alábbi tápanyagokat adjuk hozzá: Kukoricalekvár 1 g (szárazanyagtartalom: 40%) melasz 0,2 g (szárazanyagtartalom: 50%) ipari máj extraktum 0,2 ml sörélesztő-hidrolizátum 0,2 ml (szárazanyagtartalom: 20—30%) o-xilidin 0,02 g ammónium-lignoszulfonát 0,06 g (Totanin—B) ammóniumhidrogénkarbonát 1,0 g nátrium-tripolifoszfát 0,2 g ammóniumszulfát 0,2 g magnéziumklorid 0,01 g kobaltklorid 0,003 g aceton 0,01 ml 5.6- dimetilbenzimidazol-acetát 0,02 g metanol 10,0 ml. A termelő fermentálás a következő új tápanyagokat tartalmazza: nátrium-tripolifoszfát 0,2 g/1 aceton 0,01 ml/1 5.6- dimetil-benzimidazol-acetát 0,02 g. Az így végzett termelő fermentáció kb. 48 óra múlva befejeződik, amikoris a 167 658 számú magyar szabadalmi leírás alapján végzett hatóanyag meghatározás szerint 25 mg/1 hatóanyagot (Bi2-vitamin=III. faktor) tartalmaz. A termelő fermentlevet minden segédanyag nélkül sűrítményre és felülúszóra választjuk széjjel, célszerűen 6000—8000 ford/perc fodulatszámú szeparátorral. Ilymódon ~60 ml sűrítményt és ~940 ml felülúszót kapunk. A sűrítmény 21,8 mg hatóanyagot tartalmaz, azaz a szeparálás hatásfoka az eddig ismert ~50% helyett ~ 78%. A sűrítményt a kívánalmaknak megfelelően vagy kristályos Bu-vitamin vagy száraz Bi2-vitamin koncentrátum előállítására használhatjuk fel, az eddig ismert módszerek felhasználásával. A találmány szerinti eljárást — minden korlátozás nélkül az alábbi példa szemlélteti: Példa 10 literes kísérleti üvegfermentorba 2000 ml, a 167 658 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás szerinti félfolyamatos eljárással készített, az Országos Közegészségügyi Intézetnél 76., 77., 78. és 79. szám alatt deponált Corynebacterium sp.-t (jelzése 24 Al), Corynebacterium sp.-t (jelzése 62 B9), Lactobacillus sp.-t (jelzése 244 B/Cl) és Propionibacterium sp.-t (jelzése 239 A1/6) tartalmazó mezofil metántermelő vegyes mikropopulációjú üzemi fermentorból származó oltóanyagot töltünk. Az inokulumhoz 8000 ml 28—30 °C-os, az alábbi táptalajkomponenseket tartalmazó csapvizet adunk: Kukoricalekvár 50 g (szárazanyagtartalom : 40%) melasz ‘ 20 g (szárazanyagtartalom: 50%) sőrélesztőhidrolizátum 10 ml (szárazanyagtartalom: 20—30%) ipari máj extraktum 20 ml (szárazanyagtartalom: 20—30%) ammónium-lignoszulfonát 6 g (Totanin—B) ammóniumhidrogénkarbonát 30 g ammóniumhidroxid 24%-os 10 ml diammóniumhidrogénfoszfát 2 g magnéziumklorid 1 g kobaltklorid 0,1 g o-xilidin 0,1 g borostyánkősav 0,06 g glicin 0,06 g 5,6-dimetilbenzimidazol 0,06 g metanol 50,0 ml A fenti táptalaj beadagolása után a fermentlevet alaposan összekeverjük, majd a fermentort gumilappal lezárjuk és 32—34 ° C-os termosztátba helyezzük. Az összekevert fermentlében a Bi2-vitamint és biológiailag értékes III. faktort a 167 658 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban ismertetett módon meghatározzuk, a továbbiakban ezek összesített értékét hatóanyagnak nevezzük. A fermentlé 4,8 mg/l'hatóanyagot tartalmaz. Ezután a fermentorba naponta felkeverés közben fermentlé elvétel nélkül 6 napon át 50—50 ml metanolt adagulunk be. A hetedik napon a fermentációt félfolyamatossá alakítjuk át oly módon, hogy a fermentlevet alaposan felkeverjük, majd össztérfogatának 1/10 részét elvesszük. A fermentorba az elvett fermentlével azonos térfogatú, azaz 1 liter 28—30 °C-os csap vízben oldva az alábbi tápanyagokat adagoljuk be: kukoricalekvár 5 g (szárazanyagtartalom : 40%) melasz 2 g (szárazanyagtartalom: 50%) sőrélesztőhidrolizátum 2 ml (szárazanyagtartalom: 20—30%) ipari máj extraktum 2 ml (szárazanyagtartalom: 20—30%) 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
