183388. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli ST enterotoxin származékok előállítására
1 183 388 2 A találmány tárgya eljárás új immunizáló E.coli hőstabil enterotoxin származékok és a származékokat tartalmazó profilaktikus hasmenés ellenes gyógyászati és állatgyógyászati készítmények előállítására. Ismeretes, hogy az Escherichia coli törzsek felelősek lehetnek az ember és az állat hasmenéses megbetegedésének kiváltásáért. Erről különböző tanulmányok készültek, pl. Gyles és Bamum J. infect. Dis. 120.419-426, [1969]. Kimutatták, hogy az E.coli törzs enteropatogenitása az enterotoxinok termelésével kapcsolatos. Két enterotoxint írtak le: a hőlabilis enterotoxint (LT) és a hőstabil enterotoxint (ST) és Smith és Gyles (J. Med. Microbiol. 3. 387—401. 1970) enteropatogén E.coli törzseket, vagy mint LT és ST enterotoxin-termelőket, vagy mint kizálólag ST enterotoxin-termelőket osztályozta. Emberi eredetű ST termelő E.coli törzseket is leírtak különböző szerzők, pl, Giamella (Infect. Immun. 14, 95-99, 1976). A hőlabilis enterotoxint egy örökölhető plazmid szabályozza genetikusán és feltételezhetően körülbelül 24 000 molekulasúlyú összekapcsolt peptidekből áll. Az LT enterotoxint a vékonybél hámsejtjeinek kefeszegélyén a gangliozidák adszorbeálják, ahol enzimatikus úton fokozott víz és klorid kiválasztást okoznak a bélüregbe és meggátolják a nátrium újrafelszívódását úgy, hogy a bélüreg megduzzad a folyadéktól és fokozott motilitást és hasmenést okoz. Az LT enterotoxin antigén és ember és állat szérumában stimulálja a semlegesítő antitesteket az előzőleg toxin-termelő E.coli törzsekkel megfertőzött ember vagy állat szérumában. A hőstabil enterotoxint plazmidok heterogén csoportja szabályozza genetikailag, és szintén hasmenést okoz, talán a guanidin cikláz stimulálása által (J. M. Hughes és társai, Nature 271, 766-7,1978). Tekintettel arra, hogy az LT-t és ST-t termelő organizmusok ellen készített antiszérum semlegesítőleg hat az LT-re, de az ST-re nem, és tekintettel arra, hogy az ST ellen hasonlóan előállított antiszérumok nem semlegesítették sem az ST-t, sem az LT-t, Smith és Gyles (lásd fent) arra a következtetésre jutottak, hogy az ST nem antigén. A „Purification and Chemical Characterization of the Heat-Stable Enterotoxin Produced by Porcine Strains of Enterotoxygenic Escherichia coli” (Infect. Immun. 19, 1021-1030,1978) című cikkben J. F. Alderete és D. C. Robertson azt írták le, hogy a tisztított ST molekulasúlya 4400 (nátriumdodecilszulfát-gél elektroforézissel és gélszűréssel meghatározva) és az aminosav analízis adatokból 5100 molekulasúlyt számoltak, amely 47 maradéknak felel meg, és a cikk azt is leírja, hogy ST-vel vagy marhaszérumalbuminnal összekapcsolt ST-vel immunizált, nyulakból nyert antiszérum semlegesítette az enterotoxin hatását szopós egéren, azonban a passzív hemagglutináció és hemolízis titer kísérletek arra vallottak, hogy az ST gyenge antigén. Más szerzők ST molekulasúly meghatározásánál más és alacsonyabb értékeket kaptak, (pl. 1000—1200, 1500—2000 és 2500 dalion: E. V. Lee és társai, R. Lallier és társai és G. L. Madsen és társai: American Society of Microbiology konferencia, 1973, M168 számú kivonat, 1979.B34 számú kivonat és 1979, P29 számú kivonat). Ezek az eltérések feltehetőleg az ST-termelésben, izolálásban vagy tisztítási lépésben bekövetkező különbségeknek tudhatok be, valamint a különböző enzimes folyamatoknak, amelyek akkor játszódnak le, amikor az enterotoxin elhagyja a sejtet. Újabb tanulmányok (R. A. Kapitány és társai Infect. Immun. 26, 173-177, 1979) eljutnak~ä2 tásának kérdéséig, azonban az aminosavösszfet^./ hőstabilitási tulajdonságokon és biológiai hatáson alapuló különböző ST-típusok (R. A. Kapitány, lásd fent) mellékesek a találmány szempontjából, mert a találmány a különböző ST-enterotoxinok valamennyi aminosavösszetételre alkalmazható. Különböző kutatók eltérő tápközegeket és inkubációs módszereket használtak a különböző E.coli ST-termelő törzsek tenyészetében. Ilyen tápközegek pl. az F. G. Evans és társai által használt komplex tápközeg (Infect. Immun. 8, 731—35, 1973) és a J. F. Alderete és társai (Infect. Immun. 15, 781-88, 1977) által használt definiált minimál tápközeg és ezek módosulatai. Az alábbi példákban az ST enterotoxint egy sertés E.coli K12 törzsből állítottuk elő, mely az American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA) deponálóhelyen ATCC 31621 számon lett deponálva 1980. március 13-án. Az ATCC 31621 számú E.coli törzs a jól ismert E.coli KI2 törzsből származó mutáns törzs, amelyet 1922-ben izoláltak egy lábadozó diftériás beteg székletéből, és ezt használták a bakteriális genetika és molekuláris biológia alapkutatásban (B. J. Bachmann, Bacteriol. Rév. 36, 4, 525, 1972). Az E.coli K12 törzs pálcikaformájú gramnegatív baktérium, melynek hossza kb. 2 mikron és átmérője 1 mikron. A legjobb növekedés 37 °C-on észlelhető, de a törzs növekszik és osztódik 20 °C-on is. Az E.coli K12 törzs toknélküli aktív baktérium, 0’ :K: H 48 szerótípusú és igen specifikus érzékenységet mutat a lambda fággal szemben. Az E.coli ATCC 31621 törzs az E.coli K 12 törzs fenti jellegzetes tulajdonságait mutatja, továbbá auxotróf igényeket támaszt fenilalaninra, triptofánra, hisztidinre és prolinra és nem fermentál laktózt. Valószínű lac mutáció következtében (Mc Conkey - laktóz táptalajon fehér telepeket képez). Az E.coli ATCC 31621 törzs rekombináns plazmidot képez 2.1.106 dalton DNSfragmenssel, melyet eredetileg egy atogén sertés E.coli törzsből származó plazmid DNS restrikciós endonukleázos emésztésével kapunk, és amely a hőstabil enterotoxin szintézisét kódoló gént hordozza. A törzs klóramfenikollal szemben rezisztens (25 mcg/ml). Mint már említettük, a találmány nem korlátozódik sem az E.coli ATCC 31621 törzs alkalmazására, sem pedig az ezután leírt fermentációs eljárásra, a törzs és a fermentációs feltételek csak példaképpen szolgálnak az ST enterotoxin előállítására. A találmány szerint ST enterotoxin származékokat állítunk elő oly módon, hogy az ST enterotoxint fehérjéknél alkalmazható bifunkciós térhálósító szenei reagáltatjuk, és az így kapott ST enterotoxin származékok inter- vagy intramolekulárisan térhálós ST enterotoxinok, amelyeknek molekulasúlya nagyobb, mint magának az ST enterotoxinnak. Az eljárás során az ST enterotoxint nemtoxikus bifunkciós térhálósító szerrel reagáltatjuk, amely vagy homofunkciós vagy heterofunkciós reagensként hat és térhálós ST enterotoxint eredményez. Bifunkciós fehérje térhálósító szerek, amelyek homofunkcionálisan hatnak, pl. a következők lehetnek: dialdehidek, diketonok, karbodiimidek, diizocianátok, diizotiocianátok, diazidok, arildiazidok, acil-diazidok, aril (aktivált) difluoridok, arildiszulfonil (aktivált) kloridok vagy bromidok, dikarbonsav (aktivált) azidok, kloridok vagy észterek; di-a-ha-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 6C 6 b 2
