183388. lajstromszámú szabadalom • Eljárás E. coli ST enterotoxin származékok előállítására

1

183 388

loketonok: polimetilén (n = 3—12) diimedsavészterek; bisz-(maleidometil)éterek; gem-bisz-diazoacetil-alkánok; bisz-diazoarének és N,N’-arilén-dimaleimidek. Heterofunkcionális reagensekre példaképpen azokat a vegyületeket említhetjük, amelyek a fent említett térhálósító- 5 szerek két különböző, de kompatibilis funkciós csoportját tartalmazzák, különösen izocianáto- és izotiocianátoarének, (aktivált) fluor- és azidoarének; (aktivált) azido-aril-a-halogénalkü-ketonok; (aktivált) azido- és fluoroarének; klór- vagy bróm-acetimidsav rövidszénláncú alkil- 10 észterek; klórhangyasav rövidszénláncú alkilészterek és epihalohidrinek.

A fehérjéknél használatos bifunkcionális térhálósítószerek az irodalomból ismertek. így például a fehérjéknél használt mesterséges térhálósítók áttekintése megtalál- 15 ható Rosa UY és Finn WOLD: Advances in Experimental Medicine and Biology 9. fejezetében; Protein Crosslinking (Biochemical and Molecular Aspects) címmel (kiadó: Mendel Friedman, Plenum Press, New York).

A különböző térhálósító szerek közül gyakorlati 20 célokra leginkább a homofunkcionális szereket, például glutáraldehidet, difluordinitrobenzolt, diizocianát és diizotiocianát vegyületeket, valamint karbodiimideket és diimidsavésztereket használhatunk.

A találmány szerint az E.coli ST enterotoxin szárma- 25 zékokat úgy állítjuk elő, hogy az ST enterotoxint fehérjetérhálósító szerrel reagáltaljuk.

A találmány szerinti eljárásban kiindulási anyagként használt E.coli ST enterotoxin bármelyik E.coli ST enterotoxin termelőtöizsből előállítható. 30

A szupematáns kultúrában jelenlevő kapott ST enterotoxint rendszerint extraháljuk és a szennyeződések eltávolításával, pl. ultraszűréssel, gélszűrő kromatografálással, ioncserélő kromatografálással, etanollal történő extrakcióval, vagy poliakrilamid gél lemez-elektroforézis- 35 sei tisztítjuk. Ezeknek a technológiáknak a leírását megtalálhatjuk Y. Takeda és társai cikkében (Infect. Immun. 25,978-985,1979).

Minthogy az ST enterotoxin viszonylag jól áll ellen a hőnek, a találmány szerinti eljárást széles hőmérsékleti 40 intervallumon belül folytathatjuk, gyakorlatban előnyösen 37 °C alatt, különösen szobahőmérsékleten, pl. 20-25 °C körüli hőmérsékleten dolgozunk.

A reakció vizes és előnyösen pufferes közegben megy végbe, a térhálósító szer természetétől függő pH-n, így 45 pl. dialdehidek vagy diketonok esetében a reakcióelegy pH-ja nem döntő, és 4-8, előnyösen 5 körüli pH-n végezzük a reakciót. Az igen alacsony pH értékeket jobb elkerülni, hogy az aldehid önkondenzációjának lehetőségét csökkentsük. A pH 5 érték szintén megfelelő a 50 karbodiimid és diizocianát térhálósító szereknél, de az epihalogénhidrin esetében enyhén lúgos pH-t, pl. pH =

= 8-at használunk.

Ha dialdehidet vagy diketont használunk ST enterotoxin térhálósítására, amely a táptalajban alacsony kon- 55 centrációban van jelen, akkor a térhálósító reakciót úgy javíthatjuk, hogy az ST-t kisózással csapjuk ki, pl. nátriumszulfátot adunk hozzá a térhálósítószer hozzáadása előtt. A kapott ST enterotoxin származék oldékonyságát a térhálósítás különböző fokai befolyásolják. 60

A találmány szerint előállított ST enterotoxin származékokat gyógyászati vagy állatgyógyászati készítményekké készíthetjük ki, amelyek intramuszkuláris vagy orális adagolásra alkalmasak, a kikészítés során megfelelő hordozót adunk a hatóanyaghoz. Hordozóként izotóniás 65

sót vagy puffer oldatot vagy egyéb irodalomból ismert anyagot használhatunk.

Az ST enterotoxin származék vízoldékonysága szerint az adagolt gyógyászati vagy állatgyógyásazti készítmény oldat vagy szuszpenzió formájában fordulhat elő, azonban tartalmazhat még segédanyagot, pl. Freund adjuvánst (állatgyógyászati felhasználásra), vagy alumíniumhidroxidot és a gyakorlatban a készítményt fagyasztva szárított formában tároljuk és az oldatot vagy szuszpenziót például a Freund teljes adjuváns hozzáadásával azonnali felhasználásra tesszük alkalmassá. A találmány szeíint előállított ST enterotoxin származékot tartalmazó dózisegység pl. 0,1 mg térhálós ST-t tartalmaz testsúly kg-onként.

A találmány szerint előállított ST enterotoxin származékok más célt is szolgálhatnak, pl. az immuno teszthez hasznos anti ST antiszérumok könnyű előállítására alkalmasak.

2

1. példa

ATCC 31621 E.coli törzset steril fiziológiai sóoldattal rehidrálunk és 18 óra hosszat 37 °C-on Petri-csészékben inkubálunk; minden egyes Petri-csésze 20 ml feletti szelektív LB agar szilárd táptalajt tartalmaz (DIFCO Laboratories, Detroit, Michigan, Amerikai Egyesült Államokbeli cég gyártmánya), amely táptalajt milliliterenként 25 meg klóramfenikollal egészítettünk ki és amely táptalajt előzőleg 115 °C-on 45 percig hőkezeltünk.

Ezután egy folyékony tápközeget állítunk elő (PP3) oly módon, hogy Proteos pepton 3-at (DIFCO Laboratories cég terméke) 30 g mennyiségben, 4 g élesztőkivonatot és 5 g dextrózt 60 °C-on 1 liter vízben feloldunk. Hűtés után 5 g nátriumkloridot, 5,05 g dinátriumhidrogénfoszfátot és 1,2 g káliumdihidrogénfoszfátot adunk hozzá. A 6,9-7,0 pH értékű tápközeget Seitz EKS szűrőn keresztül leszűrjük, és 30 ml alikvotokat osztunk szét 250 ml-es tenyészlombikokba.

Ezeket a lombikokat beoltjuk a Petri-csészékben kapott sima kolóniákkal, 30 ml. PP3 folyékony tápközegre 4 kolóniát használva, és 7 óráig 37 °C-on rázó polcokon inkubáljuk (percenként 20—30 ringás). Ezt nevezzük „első inokulum”-nak.

Ezután 16 óra múlva átoltás következik 6 literes Erlenmayer lombikba, amely 800 ml PP3 tápközeget tartalmaz, az átoltáshoz 5 térfogat/térfogat% „első inokulum”-ot használunk. így nyerjük a „második inokulum”ot. A kapott „második inokulum”-ot használjuk inokulumként (5 térfogat/térfogat%) a termelési lépésben, amelyet 80 liter módosított Alderete tápközeget tartalmazó fermentorban végzünk. A tápközeg összetétele az alábbi 8,71 g K2HP04 ; 2,35 g NaCl; 1,0 g NU,Cl; 1,8 g tricin; N-[trisz-(hidroximetil)-metil]-glicin 50 mg MgS04J7H20; 4,95 mg MnCl2 *4H20 és 4,9 mg FeCl3 1 liter vízben, a táptalajt 30 percig 121 °C-on sterilizáljuk, majd 1,42 g 1-prolint; 0,87 g 1-aszparaginsavat, 0,39 g 1-alanint, 0,69 g 1-szerint; 0,05 g 1-fenilalanint; 0,05 g 1-hisztidint; 0,5 g 1-triptofánt és 5 g Casaminosavat (a DIFCO Laboratories, Detroit 1. Michigan, USA cég terméke) adunk hozzá 1 liter végső oldatra számítva; az aminosav-komponenseket külön állítjuk elő, mint tízszer koncentrált oldatot, melynek pH-ját 7,5-re állítottuk be és a kezdeti oldathoz való keverés előtt 30 percig 121 °C-on sterilizáltuk.

3