183319. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fokozott hatású, véralvadásgátló gyógyszerkészítmények előálítására
1 183 319 2 A találmány tárgya eljárás fokozott véralvadásgátló hatású új gyógyszerkészítmény előállítására. Ismert, hogy az antikoagulánsként használt heparin nem önmagában gátolja a vér, illetve a plazma alvadását, működéséhez szükséges egy plazmafehéije-kofaktor jelenléte (pl. R. D. Rosenberg: Ann. Rev. Med., 29, 367 /1978/). Ez a plazmafehérje az antitrombin—III (rövidítése AT), egy körülbelül 58 000 dalton mólsúlyú glikoproteid (B. Nordenman és munkatársai: Eur. J. Biochem., 78, 195 /1977/). R. D. Rosenberg és P. S. Damus (J. Biol. Chem., 248, 6490 /1973/) megállapította, hogy az antitrombin-III reakcióba lép a trombinnal. A kölcsönhatás lassú, végeredménye 1 :1 mólarányú komplex, amely proteolitikus hatást már nem mutat. Eszerint az antitrombin-III a tulajdonképpeni trombininhibitor. A heparin szerepe abban áll, hogy felgyorsítja az enzim-inhibitor komplex kialakulását, tehát a trombin-antitrombin-III kölcsönhatás katalizátorának tekinthető. Az AT-trombin komplex képződési mechanizmusában még vitatott, hogy a heparin melyik komponens reaktivitását fokozza elsődlegesen, melyik komplexből képződik a heparin-AT-trombin addukt, az AT-trombin komplex előanyaga (pl. M. F. A. Goosen: Thromb. Rés., 17, 293 /1980/). A heparin-AT és heparin-trombin komplex egyaránt kialakul izolált rendszerben (pl. B. Nordenman és I. Björk: Biochemistry, 17, 3339 (1978); illetve M. J. Griffith és munkatársai: Arch. Biochem. Biophys., 195, 378 /1979/). A heparin, a trombin és egy harmadik molekula közötti kölcsönhatást illetően megjegyzendő, hogy némely pepiid, például a benzoil-L-fenilalanil-L-valil-L-arginin-p-nitranilid szubsztrát és a trombin közötti reakciót a heparin befolyásolni tudja, amennyiben 400-nál kisebb szubsztrát/heparin mólarány esetén a hidrolízis, azaz a p-nitranilin felszabadulás kezdeti sebességét fokozza, míg ennél nagyobb mólaránynál a heparin trombingátló hatása figyelhető meg. Ez utóbbi jelenség azzal függ össze, hogy a nagyfeleslegű szubsztrát a heparinnal és a trombinnal csapadékot képez, és így csökken a reakcióelegyben oldott enzim mennyisége (M. J. Griffith és munkatársai: Thromb. Res., 1 7, 83 /1980/). A heparin-trombin komplex létezése ellenére sem tekinthető a heparin a trombin inhibitorának, miután antitrombin-III-mentes plazmában nem gátolja a trombin proteolitikus reakcióját (E. Holmer és munkatársai: Thromb. Rés., 17, 113. /1980/). Trombingátlást csak akkor figyeltek meg, ha heparin mellett antitrombin-lll-t is adtak a reakcióelegyhez, vagy normál, antitrombin-III tartalmú plazmában végezték a kísérletet. Az antitrombin-III viszonylag nagy, körülbelül 0,24 mg/ml, azaz mintegy 4X10"9 mól/ml töménységben van jelen a plazmában (D. Collen és B. Wiman: in „The Physiological Inhibitors of Coagulation and Fibrinolysis” (szerk. : D. Collen, B. Wiman és V. Verstreats), 3. oldal, Elsevier-North-Holland, Amsterdam—New York—Oxford, 1979). Megállapították, hogy az antitrombin-III plazmaszintje csökken bizonyos betegségekben, valamint fogamzásgátlók hatására és heparin-kezelés esetén is. A normál érték 75%-ánál kisebb antitrombin-III koncentrációt már veszélyesnek tartanak, és ajánlják ennek természetes antitrombin-III-koncentrátummal való pótlását (R. Egbring és munkatársai: Thrombos. Haemostas., 42, 255 /1979/). A fentiekből következik, hogy egy heparin-kofaktor/heparin kompozíció előnyösebb és általánosabban alkalmazható trombininhibitor, mint a heparin önmagában. A találmány célja olyan eljárás kidolgozása, amelynek alkalmazásával a kapott gyógyszerkombináció véralvadásgátló hatása lényegesen megnő a komponensekéhez képest, és amelyben a természetes heparin-kofaktort, a költségesen előállítható humán antitrombin-III-at szintet kus oligopeptíd helyettesíti. Vizsgálataink során azt találtuk, hogy az ismert véralvadásgátló D-fenilalanil-L-prolil-agmatin-dihidroklorid (D-Phe-Pro-Agm. 2 HC1, Agm jelentése agmatin-, azaz 4-guanidino-butilamino-csoport) és heparin együttes hatására a fibrinogén-oldat trombinnal indukált alvadásának ideje jelentősen megnyúlik, és ez nagyobb annál, mint amit a pepiid vagy a heparin önmagában kivált. A kapott eredményeket az I. táblázatban mutatjuk be feltüntetve, hogy a hatóanyagok külön-külön és együttesen milyen mértékben növelik - antitrombin-III távollétében — a fibrinogén-trombin rendszer alvadási idejét, illetve milyen alvadási időt lehetne várni az egyedi értékek alapján (a hatóanyag nélkül észlelt alvadási idő = 1). I. táblázat A heparin és D-Phe-Pro-Amg. 2 HC1 alvadásgátló hatása fibrinogén-trombin rendszerben* Hatóanyag Relatív alvadási idó' Mg/reakcióelegy heparin peptid heparin + peptid heparin peptid önmagában számított mért 0,05 0,1 U 2,5 2,6 4,0 0,10 0,1 1,5 2,5 3,0 6,0 0,05 0,2 1,1 4,0 4,1 7,5 0,10 0,2 1,5 4,0 4,5 13,0 *A rendszer összetétele: a) 200 M1 0,5%-os marhafibrinogén 0,9%-os konyhasóban, b) 5 0 m1 írisz-(hidroximetü)-metilamin-klórhidrát-sósav puffer (pH = 7,4), ami a heparint (Ph. Hg. VI szerint mérve 140 egység/mg) tartalmazza, c) 50m1 trisz-(hidroximetil)-metüamin-klórhidrát-sósav puffer (pH - 7,4), ami a pepiidet tartalmazza és d) 100 m1 US Standard Human Trombin 10 NIH egység/ml. A rendszer alvadási ideje gátló anyag nélkül 15 s. A komponensek adagolási sorrendje: b + c, + a, + d. Megjegyezzük, hogy az I. táblázatban megadottaknál nagyobb relatív alvadási időket kapunk akkor, ha a fent jelzett adagolási sorrendet megváltoztatjuk. Például a 0,1 Mg heparin és 0,1 ßg pepiid esetében talált 6-os érték helyett 9,5-öt mérünk, ha a heparint a trombinhoz adjuk, majd ezekhez a pepiidet, és végül a hármat együtt a fibrinogénhez (tehát az adagolási sorrend: b + d, + c, + a). Még nagyobb érték (11,5) érhető el olyan módon, hogy a peptid és trombin egyesített oldatához 5 perc után adjuk a heparint, majd reagál tatjuk őket a fibrinogénnel. Hasonló kísérleteket végeztünk humán citrát-plazmán is, tehát antitrombin-III jelenlétében. Heparin-kofaktorként a fenti agmatin-peptidet alkalmaztuk. A heparin mennyiségét úgy választottuk meg, hogy önmagában, illetve a plazmában jelenlévő antitrombin-III-mal csak legfeljebb kétszeres alvadási idő megnyúlást okozzon. Az eredményeket — az előzőekhez hasonlóan — a II. táblázatban mutatjuk be. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
