183319. lajstromszámú szabadalom • Eljárás fokozott hatású, véralvadásgátló gyógyszerkészítmények előálítására
1 183 319 2 II. táblázat A heparin és D-Phe-Pro-Agm. 2 HCl alvadásgátló hatása human citrát-plazmában* Hatóanyag Relatív alvadási idő Mg/reakcióelegy heparin peptid heparin + peptid heparin peptid önmagában számított mért 0,05 0,05 1,0 2,2 2,2 4,0 0,10 0,05 2,0 2,2 3,2 6,2 0,05 0,10 1,0 3,4 3,4 7,8 0,10 0,10 2,0 3,4 4,4 13,0 *A rendszer összetétele: a) 200 m1 humán citrát-plazma b) 50 trisz-(hidroximetil)-metilamin-klórhidrát-sósav puffer (pH = 7,4), ami a heparint (Ph. Hg. VI szerint mérve 140 egység/mg) tartalmazza, c) 50 /jl trisz-(hidroximetil)-metilamin-klórhidrát-sósav puffer (pH = 7,4), ami a pepiidet tartalmazza és d) 100 /al US Standard Human Thrombin 10 NIH egység/ml. A rendszer alvadási ideje gátló anyag nélkül 15 s. A komponensek adagolási sorrendje: b -f c, + a, + d. AII. táblázat adataiból látható, hogy a heparin/peptid kompozíció a plazma alvadását is jobban gátolja, mint a peptid-komponens önmagában, noha ennek antitrombin hatása egyébként is jelentős. Megjegyzendő azonban, hogy a pepiid és a heparin közötti szinergizmus csak akkor mutatható ki in vitro, ha az agmatinpeptidet és a heparint 1 mg/ml-nél hígabb oldatban egyesítjük, mert ellenkező esetben a heparin a peptiddel kölcsönhatásba lép, és egymás antitrombin/antikoaguláns aktivitását csökkentik. A trombin-peptíd komplex stabilitása jellemezhető az inhibiciós konstans (Ki) értékkel (M. Dixon: Biochem. J. 55, 170 /1953/). Minél kisebb a konstans értéke, annál kevesebb heparin-kofaktor, azaz peptid szükséges az enzim gátlásához. Fibrinogén-trombin rendszerben (összetételt lásd az I. táblázatnál) a számított Kj értékek ttM-ban a következőek: D-Phe-Pro-Agm. 2 HC1 0,3 D-Phe-Pro-Agm. 2 HC1 + heparin 0,05 A peptid/heparin arány súlyra 2:1, mólra számítva 100 :1 volt. Heparin jelenlétében hatodára csökken a Ki érték, ami azt jelenti, hogy hatszor kevesebb mennyiségű peptid szükséges ugyanolyan mennyiségű trombin gátlásához. Az agmatin-peptid és a heparin közötti szinergizmus in vivo körülmények között is megnyilvánul. In vivo kísérleteinkben 2—3 kg súlyú szürke nyulaknak subcutan adtuk a hatóanyagokat 3—6 mg/ml töménységben oldószerként fiziológiás konyhasó-oldatot alkalmazva. A vegyületek beadása után 30 perces időközökben vérmintákat vettünk a nyulak fülvénájából és Thrombelastographban meghatároztuk a teljes vér alvadási idejét (H. Harter: Zschr. f. clin. Med., 153, 423 /1955/). Egyidejűleg a vérminták protrombin aktivitását is meghatároztuk (J. A. Quick: J. Biol. Chem., 109, 73 /1935/). A D-Phe-Pro-Agm. 2 HC1 és heparin együttes hatásának vizsgálatánál alkalmazott dózisok : a) 10 mg/kg peptid b) 5 mg/kg heparin (Ph. Hg. VI szerint mérve 140 egység/mg aktivitású termék, Richter, uudapest), c) 10 mg/kg peptid és 5 mg/kg heparin együtt. Az alkalmazott dózisban az agmatin-peptid a) a teljes vér alvadási idejét nem befolyásolta, a heparin b) pedig körülbelül másfélszeresére nyújtotta (a relatív alvadási idő 1,3—1,6.) A vizsgálat ideje alatt (4 óra) a vér protrombin szintje nem változott lényegesen. A peptid és a heparin együttes adásakor c) a teljes vér relatív alvadási ideje az első három órában 4,5—3,6, a negyedik órában még 3, amikor a csak heparinnal vagy csak a peptiddel kezelt állatokban mérhető relatív alvadási idő már csak 1,3, illetve 1. Az egyidejűleg meghatározott protrombin aktivitás a kezelés előtti 100%-ról 20—30%-ra esett, ami terápiás értékű antikoaguláns hatásnak tekinthető. A heparin-kofaktorként felhasználható D-fenilalanil- L-prolil-agmatin-diklórhidrátot a 178 398 lajstromszámú magyar szabadalmi leírásban megadottak szerint állíthatjuk elő. Az alkalmazott heparin a gyógyászati célra használatos, 140 E/mg aktivitású termék a Ph. Hg. VI szerint mérve. A fentiek alapján a találmány eljárás fokozott hatású véralvadásgátló gyógyszerkészítmény előállítására, amely abban áll, hogy D-fenilalanil-L-prolil-agmatin-dihidrokloridot és 1 mg peptidre számított 50—100 E gyógyászati célra felhasználható heparint összekeverünk és gyógyszerészeti segédanyagokkal együtt a gyógyszerkészítésben szokásos módon gyógyszerkészítménnyé alakítunk. A találmány szerinti eljárás előnyös foganatosítási módja szerint az agmatin-peptidet és a heparint úgy keverjük össze, hogy súlyarányuk 2 : 1 legyen, ami megfelel 1 mg peptid esetén 70 E heparinnak. A találmány szerinti eljárás értelmében a gyógyszerkészítményt injekció vagy egyéb formába hozhatjuk. A találmány szerinti eljárással előállított kombináció előnye, hogy az ismert hatóanyagok kisebb mennyiségben való alkalmazását teszi lehetővé. A találmány szerinti eljárás foganatosítására az alábbi kiviteli példákat adjuk meg. 1. példa D-Fenilalanil-L-prolil-agmatin-heparin-oldat előállítása 10 mg liofilizált D-fenilalaníl-L-prolil-agmatin-diklórhidrátot és 5 mg liofilizált heparin-nátriumot (Ph. Hg. VI) felhasználás előtt feloldunk 3 ml izotóniás konyhasó-oldatban. 2. példa D-fenil al an il-L-pTolil-agmatin-heparin-oldat előállítása 10 mg liofilizált D-fenil-alanil-L-prolil-agmatin-diklórhidrátot és 7 mg liofilizált heparin-nátriumot felhasználás előtt külön-külön feloldunk 3, illetve 2 ml izotóniás konyhasó-oldatban. Az így nyert oldatokat összekever ük. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás fokozott hatású véralvadásgátló gyógyszerkészítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy D-fenilalanil-L-prolil-agmatin-diklórhidrátot 1 mg peptidre számított 50—100 E gyógyászati célra felhasználható heparinnal összekeverünk és gyógyszerészeti segédanyagokkal együtt a gyógyszerkészítésben szokásos módon gyógyszerkészítménnyé alakítunk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy 1 mg peptidre számítva 70 E heparint alkalmazunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 (Ábra nélkül) 3
