183303. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-galaktozioáz enzim előállítására és raffinóz ezen enzim alkalmazásával végzett hidrolízisére
1 183 303 2 A találmány tárgya: eljárás az alfa-galaktozidáz enzim (E. C. 3.2.1.2.2) egy, a Saccharomyces genushoz tartozó mikroorganizmus tenyésztésével való előállítására, valamint a raffinóz ezen enzim alkalmazásával végzett hidrolízisére. A raffinóz — egy triszaccharid, amely jelentős menynyiségben fordul elő a cukorrépában — gátolja a szaccharóz kristályosítását és ennek következtében csökken az extrakció kitermelése. Ez a körülmény komoly gazdasági problémát jelent a cukorgyárakban, amennyiben a raffinóz hidrolízise elkerülhetetlenné válik mind a kinyert cukor minőségének, mind a kristályosítási eljárás kitermelésének javítása érdekében. Számos közlemény ismertet enzimes eljárásokat a raffinóz hidrolízisére, amelyek keretében az Absidia, Aspergillus, Bacillus, Circinella, Escherichia, Micrococcus, Mortierella, Pénicillium és más genusokhoz tartozó különböző mikroorganizmus specieseket alkalmaznak. A C. A. 62 16657. sz. referátum enzimeknek extrákcióval való elkülönítését úja le általánosságban, a C. A. 91 105014 referátum pedig a Saccharomyces cerevisiae aktivitásának mutáció révén való növelésére szolgáló eljárást ismertet. Számos mikroorganizmus tenyésztése során azonban a sejtkivonat nemcsak alfa-galaktozidázt, hanem invertázt is tartalmaz, ily módon a cukorrépa-melasz kezelése során a raffinóz hidrolízisét a szaccharóz nem kívánt hidrolízise kíséri. A találmány szerinti eljárás legnagyobb előnye az, hogy az általunk kiválasztott — és a Saccharomyces genushoz tartozó — mikroorganizmus szerencsés módon egyesíti az előnyös tenyésztési idő megvalósításának lehetőségét — amely egyértelműen rövidebb, mint a penészek esetében szükséges idő — azzal a tulajdonsággal, hogy magas alfa-galaktozidáz aktivitással rendelkezik, invertáz aktivitás nélkül. Ezt a mikroorganizmust, amelyet olaj feldolgozók szennyvizéből különítettünk el a monterotondói kerületben (Róma, Olaszország), Saccharomyces cerevisiae var. oleaceus-ként osztályoztuk és a Northern Regional Center of the US Department of Agriculture intézetben (Peoria, 111) helyeztük letétbe, ahol az az NRRL Y 12056 számot kapta. A tenyésztési, morfológiai és fiziológiai jellemzőket az alábbiakban mutatjuk be. A — Tenyésztési jellemzők 1. Szilárd táptalaj (3 napos tenyésztés) : malátaagar. A telepek vaj-konzisztenciájúak, krém színűek és fényesek. 2. Folyékony tápközeg (3 napos tenyésztés) : malátakivonat. Üledék képződik. B - Morfológiai jellemzők 1. A vegetatív sejtek jellemzői: A sejtek ellipszis alakúak, hengeresek és olykor megnyúltak. 2. Pszeudomicélium vagy valódi micélium képződése: Anaerob körülmények között voluminózus pszeudomicélium van jelen. C — Szaporodási jellemzők A vegetatív sejtek közvetlenül alakulnak át ascusokká, amelyek 1-4 gömb alakú spórát tartalmaznak. D - Fiziológiai jellemzők: A szénforrások hasznosítása: a) Fermentáció: S. cerevisiae var. oie a ce us glukóz + galaktóz — maltóz — trehalóz — melibióz + raffinóz — b) Asszimiláció: S. cerevisiae var. oleaceus glukóz + galaktóz +,— maltóz — trehalóz +,— melibióz + raffinóz +,— D-mannit +,— D-glucit +,— etanol +,— glicerin +,— DL-tejsav +,A többi szénvegyület nem asszimilálható. 2. A nitrogénvegyületek asszimilációja: káliumnitrát: negatív 3. Növekedés 37 °C-on: pozitív. Az osztályozáshoz a J. P. Van der Walt által közölt sémát (The Yeasts, 2. kiadás, kiadó: J. Lodder) követtük. A találmány szerinti törzsek tenyészetei aerób körülmények között bármely ismert eljárás szerint előállíthatok, például felületi tenyészetként vagy előnyösen süllyesztett tenyészet formájában, kevertetett fermentorok alkalmazásával. A tápközeg, amely szilárd vagy folyékony lehet, egy asszimilálható szénforrást, egy nítrogénforrást és ásványi sókat tartalmaz. Szénforrásként glukózt, melibiózt, raffinózt vagy más cukrokat, glicerint és nátriumacetátot használhatunk. Nitrogénforrásként szervetlen és szerves nitrogénvegyületek, például húskivonat, élesztőkivonat, pepton, tripton, aminosavak, kazein-hidrolizátumok, szójaliszt és ammóniumsók használhatók. Az említett mikroorganizmusok alkalmazásával egy másik lényeges előny jár együtt, nevezetesen az a tény, hogy az enzim ezek glukózon való tenyésztése során képződik (az enzim konstitutív). Egy megfelelő tápközeg összetétele például a következő: élesztőkivonat 5—20 g/1 glukóz 10 g/1 NaH2 P04, MgS04, (NH4 )2 S04 nyomok 1 g/1 A tenyésztés pH-tartománya 4—7, előnyösen 5,0— 5,5, a hőmérséklet 20—40 °C, előnyösen 25—28 °C. Az enzimtermelés fokozható kis mennyiségű melibióz hozzáadásával, amely, mint tudjuk, a raffinóz részleges hidrolízisével előállított diszaccharid. A melibióz közvetlenül a táptalajhoz adható, beoltás előtt, vagy a tenyészethez, a logaritmikus növekedés szakaszának lezajlása után. Az indukciós idő 16 és 72 óra között változik, és előnyösen 40—48 óra. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 2
