183303. lajstromszámú szabadalom • Eljárás alfa-galaktozioáz enzim előállítására és raffinóz ezen enzim alkalmazásával végzett hidrolízisére
1 183 303 2 A tenyésztés közben vagy a fermentáció befejezése után elkülönített sejtek eredeti alakjukban, vagy szárított porként használhatók. Az így kapott sejteket hozzáadjuk egy reakcióelegyhez, amelynek pH-ja 4—7 és hőmérséklete 30 °C—60 °C. A melaszban található raffinózt ily módon galaktózzá és szaccharózzá hidrolizáljuk, és ennek következtében az utóbbi kitermelése javul. A találmány szerinti eljárás további részleteit a következő példákkal illusztráljuk anélkül, hogy a találmány oltalmi körét korlátozni kívánnánk. 1. példa Elkészítjük a következő összetételű tápközeget: (NH4)2S04 5 g/l MgS04.7H20 5 g/1 Na2 HP04.12H20 4,6 g/1 KH2P04 3 g/1 NaCl 0,1 g/1 CaCl2 0,05 g/1 élesztőkivonat 10 g/1 melibióz 10 g/1 Ezeket a vegyületeket ionmentesített vízben oldjuk és sósavval. pH 3,5-re savanyítjuk meg. Az így előállított tápközeget 500 ml-es, széles nyakú Erlenmeyer lombikokba osztjuk szét (100 ml táptalaj/ lombik; sterilizálás 116 °C-on 30 percen át). A lombikokat 1 ml Saccharomyces cerevisiae var. oleaceus tenyészettel oltjuk be, amelyet úgy állítottunk elő, hogy 250 ml-es lombikokban 50 ml fenti összetételű táptalajon a törzset 25 °C-on 16 órán át kevertetés mellett tenyésztettük. A fermentációs lombikokat kevertetés mellett (180 ford./perc) 25 °C-on inkubáljuk. A beoltástól számított 40 óra elteltével a tenyészetekben található sejteket centrifugálással összegyűjtjük és foszfát pufferrel (0,1 mólos, pH 5,6) mossuk. 100 ml tenyészetből 0,55 g szárított sejtet kapunk. A 100 ml térfogatú fermentléből összegyűjtött sejteket 100 ml foszfát pufferben (0,1 mólos pH 5,6) újra szuszpendáljuk és meghatározzuk az enzimaktivitást. 1 g száraz sejt kb. 1.107 enzim-egységet tartalmaz. Az enzimaktivitást a következő módszerrel mérjük. 1 ml pufferolt sejtszuszpenzióhoz 4 ml foszfát puffert (0,1 mólos pH 5,6) és — a sejtfal elbontására — néhány csepp toluolt adunk. 15 percen át kevertetés mellett 40 °C-on végzett inkubálás után a szuszpenzióhoz hozzáadunk 10 ml 1 súly/térf.%-os, foszfát pufferrel előállított (0,1 mólos, pH 5,6) melibióz oldatot adunk. A reakcióelegyet 40 °C-on 2 órán át kevertetett vízfürdőben inkubáljuk és a reakciót úgy állítjuk le, hogy a reakcióelegyből vett mintákat 15 percen át forraljuk. A melibióz hidrolízise során a reakció közben keletkezett glukóz koncentrációját a Boehringer Mannheim GmbH kolorimetriás COD-Perid módszerével határozzuk meg. A színes minták optikai sűrűségét szobahőmérsékleten Perkin-Elmer Coleman 55 spektrofotométerrel határozzuk meg; az optikai úthossz 0,1 deciméter, a hullámhossz 436 millimikron. Ha egységnyinek azt az enzim-mennyiséget tekintjük, amely 2 óra alatt az előbbi kísérleti körülmények között 1 mikrogramm glukóz keletkezését idézi elő, az egy gramm száraz sejtben található enzim mennyiségét, egységekben kifejezve, a következő képlet segítségével számíthatjuk ki: U = (E2h-Eoh)- 18,2.15,100 g száraz sejt Estandard • C ahol: E2h a két óra után vett minta optikai sűrűsége; Eoh a nulladik órában vett minta optikai sűrűsége; Estandard egy standard glukóz oldat optikai sűrűsége, amely milliliterenként 18,2 mikrogramm glukózt tartalmaz; C a 100 ml tenyészlében jelenlevő sejtmennyiség száraz súlya, grammokban. 2. példa A következő összetételű tápközeget készítjük el: (NH4)2S04 5,0 g/1 MgS04.7H20 0,5 g/1 Na2HP04.12H20 4,6 g/1 KH2P04 3,0 g/1 NaCl 0,1 g/1 CaCl2 0,05 g/1 élesztőkivonat 10 g/1 glukóz 10 g/1 A felsorolt vegyületeket ionmentesített vízben oldjuk és a pH-t oldódás után sósavval 5,3-re állítjuk be. A Saccharomyces cerevisiae var. oleaceus törzs tenyészeteit ezen a tápközegen az 1. példában megadott módon állítjuk elő; a tenyésztést rázatás mellett végezzük (orbitális, 180 ford./perc), 27 °C-on. A beoltástól számított 39 óra elteltével a fermentlében jelenlevő sejteket centrifugálással összegyűjtjük és foszfát pufferrel (0,1 mólos, pH 5,6) mossuk. 100 ml fermentléből 0,546 g száraz sejtet kapunk. A 100 ml fermentléből elkülönített sejteket 100 ml foszfát pufferben (0,1 mólos, pH 5,6) újra szuszpendáljuk és megvizsgáljuk az enzimaktivitást. 1 g száraz sejt 9,4.106 enzim-egységet tartalmaz. 3. példa Elkészítjük a következő összetételű tápközeget: (NH4)2S04 5,0 g/1 MgS04.7H20 0,5 g/1 Na2HP04.12H20 4,6 g/1 kh2po4 3,0 g/1 NaCl 0,1 g/1 CaCl2 0,05 g/1 élesztőkivonat 10 g/1 glukóz 10 g/1 melibióz 1 g/1 A felsorolt vegyületeket ion mentesített vízben oldjuk és a pH-t sósavval 5,3-re állítjuk be. Az 1. példában leírt módon előállítjuk a Saccharomyces cerevisiae var, oleaceus törzs tenyészeteit, és ezeket orbitális rázatás mellett (180 ford./perc) 27 °C-on inkubáljuk. A beoltástól számított 43 óra elteltével a fermentlében jelenlevő sejteket centrifugálással összegyűjtjük és foszfát pufferrel (0,1 mólos, pH 5,6) mossuk. 100 ml tenyészetből 0,594 g száraz sejtet kapunk. A 100 ml fermentléből összegyűjtött sejteket 100 ml foszfát pufferben (0,1 mólos, pH 5,6) újra szuszpendáljuk és meghatározzuk az enzimaktivitást. 1 g száraz sejt 1,6.107 enzim-egységet tartalmaz. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 3
