183283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunokémiailag reaktív komponensek kvalitatív és kvantitatív meghatározására
1 183 283 2 lanilR Yellow 3G diszperziós színezékeket használtunk. A megfelelő Amax értékek a 9. példában találhatók. 7.2 Nyúl (anti-HCGj IgG/- és nyúl (anti-HPL) IgG/szinezék konjugátok előállítása Az 1.2 pontban megadottak szerint jártunk el, és a következő kombinációkat állítottuk elő: ResolinR Brilliant Blue RPL/anti—HCG; és PalanilR Yellow 3G/anti—HPL. Az egyesített konjugátot úgy állítottuk elő, hogy a két konjugát egyenlő térfogatú részeit összekevertük. Mindegyik színezék-konjugátnál a végső abszorbancia (^■max'flál): 5. 7.3 MicroelisaR lapok bevonása nyúl anti-HCG-vel, nyúl anti- HPI.-lel és e kettő keverékével Az 1.3 pontban megadottak szerint jártunk el, és a szimultán vizsgálatokhoz a lapokat a következő keverékkel vontuk be: 15 ng/1 nyúl anti-HCG; és 15 ng/1 nyúl anti-HPL. 7.4 HCG és HPL szimultán meghatározása Az 1.4 pontban ismertetett vizsgálati eljárást alkalmaztuk. A Xmax értékek (etanolban) a 9. példában találhatók. a) Az egyes és az egyesített konjugátokat csak nyúl anti-HCG-vel vagy anti—HPL-lel bevont mikrotiter lapokon vizsgáltuk. A HCG-nek FFB-ben való hígítási sorozatában az egyesített konjugát és az anti-HCG konjugát egyenlő válaszjelet adott (lásd 1.4 pontot), míg az anti-HPL konjugát nem reagált. A HPL-nek FFB-ben való hígítási sorozatában az anti—HPL konjugát nagyobb válaszjelet adott, mint az egyesített konjugát, míg az anti-HCG nem ragált. b) Végül a HCG, HPL és (HCG + HPL) FFB-ben oldott mintáit egy nyúl anti-HCG-vel és anti—HPL-lel szimultán bevont, mikrotiter lap lyukjaiban inkubáltuk. A második inkubálást az egyesített konjugáttal végeztük el. Az eredmények a 2. ábrán láthatók. 8. példa DIA tesztoszteronra 8.1; 1. módszer Ez a módszer a szabad anti-tesztoszteron szilárd fázison történő detektálásán alapul, miután a tesztoszterontartalmú mintával inkubáltuk. 8.1.1 Színezék szol előállítása Az 1.1 pontban megadottak szerint jártunk el. 8.1.2 Tesztoszt eron-1 la-hemiszukcinil-BSA/szinezék szol konjugát előállítása Tesztoszteron-1 la-hemiszukcionátot feloldottunk 2 ml dimetil-formamidban (DMF), majd az oldatot lehűtöttük —15 °C-ra. 140 mg szarvasmarha szérum albumint (BSA) feloldottunk 3 ml desztillált vízben, majd hozzáadtunk 40 mikroliter 4 mól/1-es nátrium-hidroxidot és 2 ml dimetilformamidot. Ezt követően az oldatot lehűtöttük -15 °C-ra. Ezután a tesztoszteron-származék oldatához hozzáadtunk 12,5 mikroliter N-metil-morfolint és 12,5 mikroliter klórhangyasav-izobutilésztert. 3 perc múlva ezt a reakcióelegyet BSA oldathoz adtuk. A reakcióelegyet keverés közben egy órán át tartottuk —15 °C-on, majd három órán át 0 °C-on. Ezt követően a reakcióelegyet 16 órán át dializáltuk desztillált víz ellenében 4°C-on, miközben a desztillált vizet rendszeresen cseréltük. Ezután a dializált oldatot centrifugáltuk, és a tiszta szupernatáns folyadékot fagyasztva szárítottuk. Ezután előállítottuk a tesztoszteron-1 la-hemiszukcinil-BSA/színezék szol konjugátot, melyhez a nyúl anti-HCG immunoglobulinnak PalanilR Red BF szolon történő rögzítésénél ismertetett módszert használtunk. Ekkor a tesztoszteron-BSA-származékot ugyanolyan koncentrációban használtuk, mint a nyúl anti-HCG immun oglobulint. 8.1.3 MicroelisaR lapok bevonása nyúl anti-tesztoszteron immunoglobulinokkal A bevonást az 1.3 pontban megadottak szerint végeztük el, melyhez azt az immunoglobulin frakciót használtuk fel, amelyet tesztoszteron-1 la-hemiszukcinil- BSA-val végzett immunizálás segítségével kinyert nyül antiszérumból különítettünk el. 8.1 4 Tesztoszteron meghatározása Az 1.4 pontban a HCG-re ismertetett reagenseket és vizsgálati eljárást használtuk. A tesztoszteronra meghatároztunk egy standard görbét, amelynek segítségével azután a minták A516 értékein keresztül kiszámítottuk az említett eljárással kapott ismeretlen minták tesztoszteron-koncentrációját. E meghatározás kimutathatósági határa 1 ng/ml. A resztoszterontartalom szabad szemmel való leolvasással könnyen megbecsülhető (a reakció leállítása után összehasonlítjuk a standard és az ismeretlen minta szinintenzitását). 8.2; 2. módszer Ez a módszer a tesztoszteronnak (T) és a T3—BSA- nak a szilárd fázison (például polisztirol csőben vagy mikrotiter lapon) rögzített anti-(T‘ 1 —BSA)-án való kompetitiv megkötésén alapul. Detektálás után az anti(T11 - BSA)/színezék konjugáttal egy második inkubálást végzünk. Megjegyzés: T3—BSA: tesztoszteron-3-O-karboxi-metil-oxim, amely vegyértékes kötéssel kapcsolódik a BSA NH2 -csoportjához (amino-kötés); T11 - BSA: tesztoszteron-11-hemiszukcinát, amely vegyértékes kötéssel kapcsolódik a BSA NH2 - csoportjához (amino-kötés). 8.2.1 Színezék szol előállítása Az 1.1 pontban megadottak szerint jártunk el, de kolloid nyomjelzőkként SamaronR Brilliant Red H6GF és SamaronR Brilliant Yellow HIOGF diszperziós színezékeket használtunk. A megfelelő Amax értékek a 9. példában találhatók. 8.2.2 Nyúl (anti-T'1 -BSA) IgG/szinezék konjugát előállítása Az 1.2 pontban megadottak szerint jártunk el, de anti-HCG helyett nyúl anti—T11 —BSA-t használtunk. 8.2.3 MicroelisaR lapok és polisztirol csövek bevonása nyúl (anti-Tl 1 —BSA) IgG-vel 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 8
