183283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunokémiailag reaktív komponensek kvalitatív és kvantitatív meghatározására
1 183 283 2 Az 1.3 pontban megadottak szerint jártunk el, de anti—HCG helyett nyúl (anti—T11 —BSA)-t használtunk. Megjegyzés: A csövek bevonása esetén az A és B oldatok 1 ml-nyi mennyiségét használtuk. 8.2.4 Standard görbék meghatározása tesztoszteronra Elkészítettük a T és a T3—BSA FFB-ben való oldatait (lásd 1.4 pontot). a) A kompetitiv vizsgálatban felhasználható T3—BSA oldat koncentrációját a T3-BSA egy higítási sorozatának, majd a konjugátnak inkubálásával vizsgáltuk; csövekként 1 ml, illetve mikrotiter lapokként 0,1 ml oldatot használtunk. Az 1.4 pontban ismertetett eljárás szerint dolgoztunk (3-8. lépések); a Xmax(etanol) érték a 9. példában található. A teljes kompetitiv vizsgálathoz a T3 — BSA-nak 2 és 16 [pmól T/ml teljes vizsgált térfogatinak megfelelő koncentrációjú oldatát választottuk. b) A kompetitiv vizsgálatban a T3—BSA-nak 2 és 16 [pmól T/ml teljes vizsgált térfogatinak megfelelő állandó koncentrációjú oldatait, valamint a 0—64 [pmól T/ml minta] koncentrációjú higítási sorozatot használtuk. Csövek esetében: 0,9 ml tesztoszterontartalmú minta és 0,1 ml T3—BSA oldat (amely megfelel 20, illetve 160 pmól T/ml-nek). Mikrotiter lapok esetében: a megfelelő mennyiség 0,09 és 0,01 ml között változott. A továbbiakban az 1.4 pontban megadottak szerint jártunk el (3—8. lépések). A \max (etanol) érték a 9. példában található. A (kontroll - 2 X SD)-ként definiált kimutathatósági határ 0,2—0,4 [pmól T/ml minta] volt, mikor is 2 [pmól T/ml teljes vizsgálati mintáj-nak megfelelő T3 —BSA koncentrációt használtunk. A teljes detektálási tartomány körülbelül 0—8 [pmól T/ml minta] volt. RIA-val és EIA- val az 50%-os megkötődést 1, illetve 0,7 [pmól T/ml]-nél értük el. 9. példa Alternatív eljárások színezék szolok előállítására 9.1 Diszperziós színezékek Az 1.1 pontban említett PalanilR Red BF (BASF) helyett más diszperziós színezékeket is felhasználtunk színezék szolok előállítására, melyeket az alábbi táblázatban ismertettünk. ■'-max [nml ^mérési lnm|c-^ viza) etanolb) PalanilR Violet 6 R BASF 623 571 Palanil^ Yellow 3G BASF PalanilR Luminous 415 443 443 Yellow (,d) BASF PalanilR Luminous 496 464 443 Red Gd) BASF TerasilR Brilliant 520 544 540 Flavin 8GFFd) Ciba-Geigy TerasilR Brilliant 488 461 443 Pink 4BN Ciba-Geigy CibacetR 571 571 540 Violet 2R Ciba-Geigy ForonR Brilliant 538 592 549 Flavin S8GFd) Sandoz ResolinR Brilliant 433 427-Blue RRL Bayer 670 578 600 ProcinylR Blue Re) ICI SamaronR Brilliant 672-Red H6GFd) Hoechst 512 510 510 ''■max 1 nm] ^■mérési 1 nm|c3 VÍZa) etanolbl SamaronR Brilliant Yellow HIOGFd) Hoechst 451 458 443 SamaronR Brilliant Orange HFRd) Hoechst 508 499 492 SamaronR Violet HFRL Hoechst 566 543 540 a) Kolloid oldatként. b) Molekuláris oldatként. c) A jelenleg rendelkezésre álló szú'ró'k miatt ezeket az értékeket ha sználtuk. d) A diszperziós színezékek azon képviselői, amelyek fluorometriás módszerrel is kimutathatók. e) A ..reaktív” diszperziós színezékek egyik képviselője. A kereskedelemben kapható színezékekből szolokat állítottunk elő. Száraz, porszerű termékek esetében a színezék 5 v%-os, desztillált vízzel készült diszperzióiból indultunk ki. Folyékony készítmények esetében pedig a kísérleteket 5 tf%-os, desztillált vízzel készült diszperziókkal kezdtük el. A színezék vizes diszperziójának frakcionálását centrifugálissal hajtottuk végre az 1.1 pontban megadottak szerint. A szemcseméretekre történő frakcionálást szintén meghatározott pórusméretű szűrők segítségével hajtottuk végre. Ily módon felhasználásra alkalmas szolokat kaptunk, azonban a színezék hozama jelentősen kisebb volt, mint a centrifugálás esetében, továbbá a módszer igen időigényes. A hidrodinamikus kromatográfia és a gradiensek használata a centrifugálás folyamán a fent említett eljárások hasznos kiegészítőjeként szolgál. 9.2 Transzfer színezékek A *ranszfer színezékek olyan színezékek, melyeket a transzfer nyomás folyamán használnak, mikor is egy színes mintát egyik felületről a másikra - általában papírról textilre - visznek át. A „szublisztatikus-, szublimációs-, száraz-meleg- vagy termonyomásos eljárásokban” szublimálható szerves színezékeket hasznosítanak, amelyek általában vízben oldhatatlanok, míg szerves közegber oldhatók. Az ilyen típusú színezék szoljai a „kondenzációs módszerrel” [lásd J. Th. G. Overbeek; H. R. Kruyt (Ed.), „Colloid Science”, Vol. /, 59—60, Elsevier, Amsterdam (1952)] vízben is előállíthatók. 9.2.1 lurafixR Blue FFR (BASFj 49 ml desztillált vízhez erőteljes keverés közben hozzáadtuk LurafixR Blue FFR acetonnal készült, 2, 1,5, I, 0, 0,8, 0,6 és 0,2 g/1 koncentrációjú oldatait (1 ml). A kapott szuszpenziókat 30 percig centrifugáltuk (1000 g = 9800 N/kg), és a pelleteket 50 ml desztillált vízzel nostuk, majd az előbbiek szerint ismét centrifugáltuk. Ezt követően a pelleteket olyan mennyiségű desztillált vízben szuszpendáltuk, hogy a végső koncentráció 0,1 mg/ml legyen. A végső színezék szolokat úgy kaptuk, hogy a különböző szuszpenziókat ultrahangos kezelésiek vetettük alá (Branson Sonifier B-12, 2 perc, 70 wat :). 750 és 360 nm között feljegyeztük a színezék szolok abszorpciós spektrumát. A 2 g/l-től 0,2 g/l-ig terjedő eredeti színezék/aceton koncentrációnak megfelelő szolokból kiindulva a Xmax értéke 716-ról 617nm-re esett vissza. Ezek a spektrális változások a szemcseméret csökkenésére utalnak [lásd H. R. Kruyt, „Colloids”, 132. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
