183283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunokémiailag reaktív komponensek kvalitatív és kvantitatív meghatározására
1 183 283 2 10.3 Tisztítási eljárás a konjugát előállítás utáni elkülönítésére Többek között a következő eljárások vehetők számításba a tisztításra: — centrifugálás; — gélkrcmatográfia; — affinitáskromatográfia; — membránszűrés; — részleges kicsapás (flokkulálás, mosás, majd a szol visszaállítása). Részletesen a centrifugálást és a gélkromatográfiát vizsgáltuk, és az eredményeket összehasonlítottuk azon konjugátokkal kapott eredményekkel, amelyeket nem tisztítottunk, de egyébként azonosítható módon állítottunk elő. Erre a célra 10.2-c szerinti, nem tisztított konjugát ot használtunk. 10.3- a Gél kromatográfia 4 ml konjugátot (A| íTM= 5,0) átáramoltattunk egy SepharoseK CL 2B oszlopon (Pharmacia K 16/20; agytérfogat: 35 ml; 5 mmól NaCl + 0,2 g BSA + 1,0 g NaN3/liter oldattal ekvilibrált; pH = 7,0). Az oszlopot ekvilibráló pufferrel eluáltuk (szobahőmérséklet, 30 ml/óra); az.eluátum detektálása az A2so mérésével történt. 1,3 ml-es frakciókat gyűjtöttünk össze; a színezék-csúcs fő frakcióit összekevertük. 10.3- b Cen trifugálás 4 ml konjugátot (A* 3e?1 = 5,0) 30 percig centrifugáltunk (4000 g = 39 200 N/kg), és 4 ml végtérfogatra újra szuszpendáltuk, melyhez 7,0 pH-jú, 5 mmól NaCl + 0,2 g BSA + 1,0 g NaN3/liter oldatot használtunk. 10. 3-c Tisztítás nélküli minta Erre a célra tisztítatlan, 10.2-c szerinti konjugátot használtunk. A három konjugátot az 1.4 pontban ismertetett eljárás szerint DIA-val (szendvics-vizsgálat) vizsgáltuk. A 10.2 pont szerinti HCG hígítási sorozatot használtunk. Konjugát As 16 HCG (IU/1) 0 250 1000 4000 Hozam (7c) 10.3-a 0,228 0,551 0,713 0,505 4,3 b 0,218 0,339 0,456 0,557 93,6 c 0,234 0,418 0,583 0,700 100,0 10.4 A konjugát előállítása során alkalmazott immunoglobulin-koncentráció hatása a végső immuno-aktivitásra Az 1.1 pontban megadottak szerinti eljárással PalanilR Red BF (BASF) színezékből előállított színezék szol 5 ml-es mintáit összekevertük 0,1 ml nyúl anti— HCG immunoglobulin oldattal (5 mmól NaCl/1, pH = 7,0), így a következő végső koncentrációjú oldatokat állítottuk elő: 10.4- a: 10mg/l; 10.4- b: 20 mg/l; 10.4- c: 40 mg/l; 10.4- d: 80 mg/l. Egyórás, szobahőmérsékleten végzett inkubálás után hozzáadtunk 0,1 ml BSA oldatot (5 mmól NaCl + 20 g BSA/1, pH = 7,0), ily módon 0,4 g BSA/1 végső koncentrációjú oldatot kaptunk. Egyórás, szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a szolokat 30 percig centrifugáltuk (4000 g = 39 200 N/kg), a szupernatáns folyadékokat eltávolítottuk, majd a pelleteket 5 ml-es végső térfogatra ismét szuszpendáltuk,. melyhez egy 7,0-es pH-jú és 5 mmól NaCl + 0,4 g BSA + 0,1 g nátrium-mertiolát/liter összetételű oldatot használtunk. A konjugátok immuno-aktivitását az 1.4 pontban megadottak szerint DIA-val határoztuk meg (szendvicsvizsgálat); hígítási sorozatként pedig a 10.2 pontban ismertetett HCG hígítási sorozatot használtuk. Konjugát As 16 HCG (1U/1) 0 250 1000 4000 10.4-a 0,268 0,499 0,761 1,000 b 0,362 0,658 0,902 1,141 c 0,511 0,741 0,913 1,107 d 0,507 0,681 0,847 0,955 10.5 Az anti-HCG immunoglobulin típusának hatása a konjugát immuno-aktivitására; bárány és nyúl anti- HCG szérumból elkülönített anti -HCG immunoglobulin, valamint monoklón egér anti-HCG immunoglobulin felhasználása Az anti—HCG immunoglobulin/színezék szol konjugátokat oly módon állítottuk elő, hogy PalanilR Red BF szol mintákat (5 ml, As3c31=5,0) - amelyeket az 1.1 pontban megadottak szerint állítottunk elő — az alábbi módon bevonattal láttunk el: 10.5-a Bárány anti-HCG immunoglobulin A fehérje oldatot (0,1 ml, 1 g/1 egy 5 mmól NaCl/1 oldatban, pH = 7,0) hozzáadtuk a szolhoz, és a reakcióelegyet egy órán át inkubáltuk szobahőmérsékleten. Ekko hozzáadtunk egy BSA oldatot (0,1 ml, 20 g/1 egy 5 mmólNaCl/1 oldatban, pH = 7,0), majd egyórás, szobahőmérsékleten végzett inkubálás után a szolt 30 percig centrifugáltuk (4000 g = 39 200 N/kg). A szupernatáns folyadékot eltávolítottuk, majd a pelleteket egy 5 mmól NaCl + 0,4 g BSA + 0,1 g nátrium-mertiolát/liter (pH=7,0) összetételű oldatban 5 ml végső térfogatra újra szuszpendáltuk. 10 5-b Nyúl anti-HCG immunoglobulin Megismételtük a 10.5-a pont szerinti eljárást, de nyúl immunoglobulint használtunk. 10 5-c Monoklón egér anti-HCG immunoglobulin Megismételtük a 10.5-a pont szerinti eljárást, de egér immimoglobulint használtunk az alábbi mennyiségekben: 10.5- c-l : 0,1 ml immunoglobulin oldat (1 g/1, 5 mmól NaCl/1, pH = 7,0); 10.5- C-2: 0,1 ml immunoglobulin oldat (0.25 g/1, 5 mmól NaCl/1, pH = 7,0). A konjugátok immuno-aktivitását az 1.4 pontban megadottak szerint DIA-val határoztuk meg (szendvicsvizsgálat). A következő HCG hígítási sorozatot használtuk: 0, 15,6, 62,5, 250, 1000 és 4000 IU (immunovizsgálat)/!. Konjugát A516 HCG (IU/1) 0 15,6 62,5 250 1000 4000 10.5-a 0,483 0,509 0,552 0,618 0,789 1,032 b 0,556 0,608 0,649 0,710 0,877 1,114 c-1 0,406 0,432 0,450 0,503 0,536 0,586 c-2 0,437 0,495 0,497 0,528 0,559 0,65 3 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 12
