183283. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunokémiailag reaktív komponensek kvalitatív és kvantitatív meghatározására

1

183 283

2

10.6 A másodlagos bevonás során biztosított BSA koncentráció hatása a konjugát immuno-aktivitására Az 1.1 és 1.2 pontban megadottak szerint elkészítettük a PalanilR Red BF (BASF) diszperziós színezék konjugátjait. A BSA koncentrációjában a következő változatokat alkalmaztuk:

BSA koncentráció a hozzáadott oldatban [g/1]

BSA koncentráció a reakcióelegyben [g/1]

10.6-a

9,6

1,6

b

19,2

3,2

c

38,4

6,4

d

76,8

12,8

e

153,6

25,6

f

307,2

51,2

A konjugátokat az 1.2 pontban megadottak szerint különítettük el, majd végül a következő összetételű oldatban újra szuszpendáltuk azokat: 5 mmól NaCl + 0,1 g nátrium-mertiolát + X g BSA/1 (a pH 0,1 mól/1 NaOH-dal 7,0-ra beállítva); a BSA koncentrációja mindig megegyezik a másodlagos bevonás műveleténél alkalmazottal. így rendre: X = 1,6. 3.2................., 5 1,2 g/1 (lásd

táblázat).

A konjugátok immuno-aktivitását az 1.4 pontban megadottak szerint DIA-val határoztuk meg (szendvicsvizsgálat). Ennek során az alábbi HCG hígítási sorozatot használtuk: 0, 3,9, 15.6, 62,5, 250, 1000, 4000 és 16 000 IU (immuno-vizsgálat)/l.

Konj ugát

As 1 6

HCG (IU/1)

0

3,9

15,6

62,5

250

1000

4000

16 000

10.6-a

0,322

0,397

0.378

0.436

0,5 65

0,773

0.954

1,034

b

0,254

0.282

0,286

0.344

0,489

0,707

0,892

0,960

C

0,137

0.154

0,175

0,235

0.397

0,661

0,812

0,906

d

0.062

0.07 8

0.095

0.147

0,297

0,594

0,7 78

0,852

l?

0.039

0.040

0.054

0.110

0.283

0,572

0.759

0,843

f

0.021

0,029

0.044

0,111

0.310

0.629

0,803

0,882

11. példa

Humán magzatburki gonadotropin (HCG) kolorimetriás és/vagy vizuális meghatározása a DIA elv alapján (agglucinációs vizsgálat; 1. módszer)

11.1 Színezék szol előállítása

Az 1.1 pontban megadottak szerint jártunk el.

11.2 Nyúl anti -HCG immunoglobulin/színezék szol konjugát előállítása

Az 1.2 pontban megadottak szerint jártunk el, csak ebben az esetben a BSA oldat nem 2,4 g/1, hanem - aminthogy a pelletet az ismertetett összetételű oldatban újra szuszpendáltuk - 0,4 g/1 BSA-t tartalmazott. Akonjugátot végül tovább hígítottuk az Asl3<'3m=2,2 érték eléréséig.

11.3 HCG meghatározása foszjátpufferben vagy vizeletben

TRIS puffer: 1 mól TRIS + 1 mól NaCl + 10 g BSA/1. A pH értékét 4 mól/1 HCl-dal 7,4-re állítottuk be.

HCG: lásd 1.4 pontot.

Vizelet: lásd 1.4 pontot.

Foyzfátpuffer (FFB): lásd 1.4 pontot.

Konjugát: lásd 11.2 pontot.

Eljárás:

1. A standard HCG-oldatot FFB-vel vagy vizelettel felhígítva 5000 és 1000 IU (immuno-vizsgálat)/1 koncentrációjú HCG-oldatot készítettünk.

2. Egy cellába (1 cm-es fényút) bepipettáztunk 1 ml konjugátot, 0,1 ml TRIS puffert és 0,11 ml HCG-oldatot. Alaposan összekevertük, majd a 750-360 nm-es tartományban felvettük az abszorpciós spektrumokat. Referenciaként FFB-t és vizeletet használtunk.

3. A cellákat 20 órán keresztül állni hagytuk szobahőmérsékleten, majd vizuális kiértékelést végeztünk. Ezt követően alapos összezárás után még egyszer felvettük az abszorpciós spektrumokat 750—360 nm-es tartományban

A spektrumok a 3. ábrán láthatók, míg a számszerű ada'okat az alábbi táblázatban foglaltuk össze.

HCG koncentráció. |IU/1|

Vizuálisan*!-^5 3 3 )o (AS 3 3 ) x ^

» 5^0 (A 5 7 5 )x

0-0

0

noo

+

0,15

0,14

5100

+ +

0,40

0,21

*)

: nincs agglutináeió/aggregáció. A színezek szol stabilis. „ + ’ : kezdődő agglutináeió/aggregáció. A szupernatáns

folyadék a szedimentáció következtében világosabb színű a megfelelő Kontroll mintánál (O III HCG/1).

„ + : teljes agglutináeió/aggregáció. A színezék szol

teljesen flokkulált és a színezék kicsapódott.

*

O : OIU HCG/1.

x : 1, illetve 5 IU HCG/1.

12. példa

Humán magzatburki gonadotropin (HCG) kolorimetriás meghátározása a DIA elv alapján (agglutinációs vizsgálat; 2. módszer)

12.1 Színezék szol előállítása

Lásd 1.1 pontot.

12.2 Általános vizsgálati eljárás a DIA/agglutinációra

A színezék/immunoglobulin konjugát 2 ml-es mintáját

bepipettáztuk egy üveg vagy polisztirol küvettába, és összekevertük 0,2 ml, FFB-ben oldott antigén mintával (lásd 1.4 pontot) — vagy csak 0,2 ml FFB-vel — és 0,2 ml desztillált vízzel vagy MgS04 desztillált vízzel készült oldatával. A küvettákat (keverés nélkül) szobahőmérsékleten tartottuk, és rendszeres időközökben (előzetes keverés nélkül) megmértük az abszorbanciákat. Az antigén a színezék szol részecskéinek agglutinációját idézi elő, ami a megnövekedett effektiv szemcseméret miatt, valamin az aggregátumok ezzel együttjáró szedimentációja miatt az abszorbancia csökkenéséhez vezet. Az összes további kísérlet a HCG meghatározásával kapcsolatos.

/ 2.3 Nyúl (anti-HCG) IgG/szinezék konjugát előállítása

standard eljárás; lásd 11.2 pontot.

Az optimalizálást a következő paraméterek vizsgálatával végeztük el:

'2.3.1 Konjugátok másodlagos bevonása BSA-val

\ DIA/szendvics-vizsgálatra szánt konjugátokat a nem-specifikus hatások csökkentése céljából bevontuk

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

13