183266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás claviceps purpurea törzsek által termelt szűretlen fearmentlevaek kivonatolására
1 183 266 2 A fermentációt önmagában ismert módon, például a 164 016 számú magyar szabadalmi leírásban leírt módon végezhetjük, ügyelve azonban arra, hogy a fermentáció befejeztével a fermentlé pH-értéke 4,0—5,5 között, előnyösen 4,7-5,2 között legyen. A fermentléhez kívánt esetben a táptalaj ozmózisos nyomását megnövelő valamely adalékot adunk a 153 739 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett módszer szerint. Ozmózisos nyomást növelő adalékként elsősorban szervetlen vagy szerves sókat, így nátrium-, kálium-, kalcium- és magnézium-kloridot, -szulfátot, -karbonátot, -foszfátot, -acetátot, -szukcinátot vagy -aszparaginátot, vagy mono- vagy diszacharidokat, így mannitot, szorbitot, glukózt vagy szacharózt használhatunk. A fermentáció lezajlása után a szüretien fermentlevet szakaszos vagy folyamatos üzemű extraktorban vízzel nem, vagy csak korlátoltan elegyedő oldószerrel extraháljuk, anélkül, hogy előzőleg a fermentlé pH-ján változtatnánk. Extrahálószerként elsősorban vízzel nem, vagy csak korlátoltan elegyedő rövid szénláncú alifás ketonokat, előnyösen metil-izobutil-Ketont, vagy rövid szénláncú alifás karbonsavésztereket, előnyösen etilacetátot, vagy valamely klórozott szénhidrogént, előnyösen kloroformot vagy diklóretánt alkalmazhatunk. Az extrakció során ügyelünk arra, hogy a szűetlen fermentlé és az extrahálószer a gombasejtek megfelelő kivonatolásához szükséges ideig érintkezzék egymással. Az extrakciót célszerűen keverés közben és előnyösen az extraktor elé beiktatott előkeverő tartály alkalmazásával hajtjuk végre, úgy, hogy az extrahálószer és a szüretien fermentlé megfelelő ideig tartózkodjon együtt. Műveletileg elfogadható keverési viszonyok mellett körülbelül 3 perc alatt elérhető a gombasejtek max. extrahálhatósági fokának 95 %-n. Általában, és a keverési viszonyoktól függően 3—15. előnyösen 3-8 perc az optimális extrákciós idő. Az extraktumból bepárlás és/vagy petrolétercs kicsapással nyerhetjük ki az ergotoxin típusú alkaloidokat. A kiextrahált fermentlé pH-értékét ezután pH 7-9-re állítjuk be, majd önmagában ismert módon, célszerűen maleinsav só alakjában kinyerjük a vízoldékony alkaloidokat. Eljárásunkat közelebbről a következő példákkal szemléltetjük, anélkül, hogy igényünket a példákra korlátoznánk. 1. példa A 164 816 számú magyar szabadalmi leírás szerinti eljárással, MNG 00088 számon deponált Claviceps purpurea törzs, és a 153 739 számú magyar szabadalmi leírás szerinti, a táptalaj ozmózisos nyomását növelő adalék alkalmazásával kapott 250 liter szubmerz tenyészetet, melynek alkaloidtartalma 0,812 mg/ml ergotoxin típusú alkaloid és 0,350 mg/ml ergometrin, a fermentáció befejezésekor a fermentlé saját 4,8-as pH-értékén 125 liter metil-izobutilketonnal 10 percig extrahálunk keverés közben. Ezután az extrahált fermentlevet és mieéliurnot, valamint az extraklumot tartalmazó keveréket szűrőcentrifugán szűrjük, majd a fázisokat szétválasztjuk. A vizes fázishoz ismét 125 litei metiiizobutilketont adunk, ismét hozzáadjuk a mieéliurnot és a keveréket 10 percig ismét keverjük, majd szűrés után a fázisokat szétválasztjuk. Az oldószeres fázist vákuumban max. 40 °C-on 2 literre bepároljuk, majd a bepárlási maradékot intenzív keverés közben 20 liter pelroléterbe öntjük. A kivált csapadékot 10 percig állni hagyjuk, szűrjük, kétszer 0,1 liter petroléterrel mossuk, majd vákuumban max. 40 °C-on megszárítjuk. A kapott termék 279,5 g. A termék összetétele: 730 mg/g ergotoxin típusú alkaloid és 20 mg/g ergometrin. A vizes fázis és a micélium keverékének pH-értékét ezután 8-ra állítjuk be tömény vizes ammóniumhidroxidoldattal, majd kétszer 125 liter metil-izobutilketonnal keverés közben extraháljuk. A reakciókeverékből szűréssel, majd a folyadékfázisok szétválasztásával nyerjük a vízoldható alkaloidokat tartalmazó extraktumokat. Az egyesített szerves fázist vákuumban max. 40 °C-on 5 literre bepároljuk, majd pH 4 érték eléréséig intenzív keverés közben metil-izobutilketonos maleinsav-oldatot adunk a bepárlási maradékhoz. A kivált ergometrinmaleátot szűrjük, 2x300 ml metil-izobutilketonnal mossuk, majd vákuumban max. 40 °C-on megszárítjuk. A kapott termék 116,4 g, mely 683 mg/g ergometrint tartalmaz ergometrin-maleát formájában. 2. példa A 164 816 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett fermentációs eljárással, de MNG 00186 számon deponált Claviceps purpurea variáns törzs alkalmazásával előállított 100 liter fermentlevet, melyben az ergokomin és epimerje 0,351 mg/ml, az a-ergokriptin és epimerje 0,137 mg/ml és a /3-ergokriptin és epimerje 0,152 mg/ml koncentrációban van jelen, a fermentáció leállítása után, a fermentlé saját pH-ján (5,2) keverős extraktorba nyomatunk 40 liter/óra sebességgel és egyidejűleg 30 liter/óra sebességgel etilacetátot adagolunk hozzá. Ezután a kevert elegyet kamrás, önürítős szeparátorra! etilacetátos és vizes-mteéliumos fázisra választjuk szét. A műveletet úgy irányítjuk, hogy a fermentlé tartózkodási ideje az extraktorban 6-8 perc legyen. A szeparálás után az etilacetátos extraktumban az ergokomin és epimerje 0,427 mg/ml, az a-ergokriptin és epimerje 0,172 mg/ml és a /3-ergokriptin és epimerje 0,187 mg/ml koncentrációban van jelen. 3. példa A 164 816 számú magyar szabadalmi leírás szerinti eljárással, MNG 00022 számon deponált Claviceps purpurea törzs alkalmazásával nyert 10 m3 fermentlevet, melyben az ergokomin és epimerje 0,423 mg/ml, az a-ergokriptin, és epimerje 0,381 mg/ml és a /3-ergokriptin és epimerje 0,093 mg/ml koncentrációban van jelen, a szüretien fermentlé saját pH-ján (az adott esetben pH 4,5) kétszer extrahálunk. Az extrakciót 1500/perc fordulatszámmal üzemeltetett Podbielniak D 36 extraktorban etílacetáttal végezzük; 1 m3 fermentlére számítva 2x400 liter etilacetátot alkalmazunk. Átlagosan 6 perces tartózkodási idő biztosítására egy előkeverő tartályt alkalmazunk, melyben a szüretien fermentlevet 40 térfogat% etílacetáttal, illetve az extrakció beindulása után 40 térfogati) etilacetátos extraktummal kever jük. Az extraktort oly rr «.ion üzemeltetjük, hogy az extraktorban az ctilaceta. képezze a folytonos fázist, s ebben legyen diszpergálva a fermentlé; az extraktoron belüli aktív szakaszban tehát 0,1—0,15 liter fermentlére körülbelül 1 liter etil-5 10 15 20 25 30 '35 40 45 50 55 60 65 3
