183266. lajstromszámú szabadalom • Eljárás claviceps purpurea törzsek által termelt szűretlen fearmentlevaek kivonatolására
183 266 2 A találmány tárgya új eljárás Claviceps purpurea törzsek szaprofita körülmények között való alkalmazásakor keletkező szüretien fermentlevek kivonatolására. A szaprofita körülmények között termelő Claviceps purpurea törzsek elsősorban peptid-alkaloidokat, vagy más néven ergotoxin típusú alkaloidokat, ezek közül is főként ergokornint és epimerjét, az ergokominint, valamint a- és jS-ergokriptint és ezek epimerjeit, az a- és /S-ergokriptinint, továbbá adott esetben nem peptid típusú alkaloidokat, így ergomctrint cs epimerjét, az crgometrinint állítanak elő. Az előállított alkaloidok közül az ergometrin és epimerje vízoldható. Vízoldékony alkaloidok előállítására vonatkozik a 164 658 számú magyar szabadalmi leírás, melyeket a szűrt fermcntléből lúgos pH-értéken, extrakciós úton nyernek ki. A kiszűrt micélium feldolgozását ez az eljárás nem oldja meg. Főként ergotoxin típusú alkaloidok előállítására vonatkozik az 1 158 380 számú brit szabadalmi leírás, mely szerint a fermentleyet szűrik, és a szűrletet, valamint a micéliumot külön-külön extrahálják. Az ergotoxin típusú alkaloidokat a micéliumból 2 %-os vizes borkősav és aceton eiegyével kivonatolják, a kivonatot besűrítik, majd lúgos pH-értéken kloroformmal oldják ki az ergotoxin típusú alkaloidokat, melyeket ezután kromatografálással tisztítanak. A szűrt fermentléből kloroformmal további ergotoxin típusú alkaloidokat nyernek ki. Ugyancsak szűrt fermentlé feldolgozására vonatkozik a 17 1 659 szánni magyar szabadalmi leírás, mely szerint az ergotoxin típusú alkaloidokat a szűréssel elkülönített micéliumból lúgos pH-értékén ammeniás etilacetáttal oldják ki. Minthogy a nagy mennyiségű fermentlé szűrése elég komoly szűrőkapacitást igényel, és a fermentlé szűrhetősége nagymértékben befolyásolta az egyes alkaloidok kinyerhetőségét, az újabb eljárások kidolgozásánál a szűrés elkerülésére törekedtek. A szűrés nélküli eljárásoknál azonban a vízoldékony és az ergotoxin típusú alkaloidok együtt jelentek meg az extraktumban, illetve mindkét alkaloid típusból marad a micéliumban is, ezért a két alkaloid típus szétválasztásához újabb fáziscserékre van szükség. Ilyen jellegű, szüretien fermentlé feldolgozási módszeren alapul a 164 116 számú magyar szabadalmi leírásban ismertetett eljárás, mely szerint a szüretien fermentlé pH-értékét 7-re állítják be, majd ammóniumszulfáttal telítik, és acetonnal extrahálják. Az extraktum pH-értékét 3,5-re állítják be, részlegesen bcpárolják, majd a maradékból kloroformos kivonatolással különítik el az ergotoxin típusú alkaloidokat, melyeket kromatografálással tisztítanak. A 180 287 lajstromszámú magyar szabadalmi leírás is részben olyan módszert ismertet, mely szüretien fermentlé feldolgozásán alapul. A szüretien fermentlé pH-értékct 9-I()-re állítják, majd metil-izobutilketonnal extrahálják a peptidalkaloidokat, melyeket ezután savas vízbe, majd ismét kloroformba oldanak át. Kísérleteink során azt találtuk, hogy a pcptidalkaloidok kinyerésére alkalmazott három lépés egyetlen extrakciós lépésre összevcínható, ha a szüretien fermentlevet savanyú pH-tartományban, pH 4,0-5,5 között extraháljuk. A peptidalkaloidok extrakciója ebben a jellemző pH- tartományban még megfelelően szelektív, azaz a korábbihoz képest (pH 3,5, borkősavas közeg) emelt pH ellenére, a vízoldékony alkaloidok a vizes fázisban maradnak. Ugyanakkor meglepő módon a választott pH 4,0—5,5 közötti tartomány esetében a peptidalkaloid extrakció hatásfoka kedvezőbb, mint lúgos pH-n végzett extrakcióknál. Ennek magyarázatául részletes vizsgálataink során azt találtuk, hogy amennyiben a fermentlevet extrakció előtt vagy extrakció közben lúgosítjuk, úgy abból nagy molekulasúlyú szerves anyagok csapódnak ki, melyek az alkaloidok jelentős részét adszorbeálni képesek. Amennyiben a lúgos tartományban végzett extrakciónál kisózást is alkalmaznak, ezen csapadékok képződése tovább erősödik, és az elválaszthatóság és nyeredék egyaránt romlik. Eljárásunk lényegének tekintjük tehát, hogy az extrák - ciót pH-emelés nem előzheti meg, a fermentáció vitelében kell biztosítani, hogy leállításakor a fermentlé pH-ja a kívánt 4,0—5,5 tartományba essék. További lényeges megfigyelés, hogy micéliumot tartalmazó fermentlé extrakciója közben két folyamat együttes lefutása zajlik le. Az extrakció során egyrészt meg kell hogy történjék a sejtek alkaloid-tartalmának kivonatolása, másrészt meg kell hogy történjék a vizes közegből oldószeres közegbe való alkaloid-átvitel. Emiatt az extrakcíó során nem elegendő az alkaloidok megoszlásából és az extraháló berendezés jellegéből következő tartózkodási idő beállítása, hanem többletidőre van szükség ahhoz, hogy a sejtek kivonatolását is teljessé tegyük. Meglepő, és korábban egyetlen esetben sem felismert jellemző tehát, hogy az. extrakció időszükségletét a sejtkivonatolás hatásfoka szabja meg. így az extrakció során a sejtkívonatoláshoz szükséges idő biztosítása az, amelyre feltétlenül ügyelni kell. Az extrakció bármely műveleti megoldásban kivitelezhető. Szakaszos extrakciót alkalmazva, az oldószeres kikeverést 2-3 ismétlésben végezzük. Extrahálhatjuk továbbá a szüretien fermentlevet például RDC extrakforban, vagy ellenáramú forgódobos (például Podbielniak) extraktoron. A találmány szerinti pH 4,0-5,5 tartomány betartása a műveletek elvégzésénél azt a műszaki előnyt hozza, hogy elkerülve a csapadékképződést, a fázisok szétválasztása lényegesen egyszerűbb feladattá válik. A találmány tárgya tehát eljárás Claviceps purpurea törzsek által termelt szüretien fermentlevek vízzel nem, vagy csak korlátoltan elegyedő szerves oldószerrel történő kivonatolására, azzal jellemezve, hogy a szüretien fermentlevet, melynek pH-értéke a fermentáció befejezésekor 4,0—5,5, vízzel nem, vagy csak korlátoltan elegyedő, szerves oldószerrel a fermentlé saját pH-értékén a gombasejtek kivonatolásához szükséges ideig extrahálunk. az extraktumból a főként ergotoxin típusú alkaloidokat tartalmazó alkaloidkeveréket kinyerjük, és kívánt esetben a kiextrahált fermentléből, előnyösen a pH-érték 7-9-re történő beállítása után, a főként vízoldékony anyarozsalkaloidokat tartalmazó alkaloidkeveréket kinyerjük. A találmány szerinti eljárás értelmében Claviceps purpurea gombatörzsek által termelt szüretien ferment- Icvckből indulunk ki. Gombatörzsként főként ergotoxin típusú alkaloidokat, ezek közül is főként ergokornint és epimerjét, a- és /3-ergokriptint, valamint ezek epimerjeit, továbbá adott esetben vízoldékony anyarozsalkaloidokat is termelő Claviceps purpurea törzseket alkalmazunk. Előnyösen az OKI-nál MN G 00022, MNG 00088 és MNG 00186 deponált törzset alkalmazhatunk. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
