183202. lajstromszámú szabadalom • Eljárás koleszterinészteráz előállítására
1 ] 83 20', 2 A. találmány tárgya eljárás kohrrteriaé.vztsíá?. előáll! lására mikroorganizmusok segítségéve!. A koleszletinészteráz fontos szerepet játszik a klinikai és biokémiai analitikában, mióta eljárásokat dolgoztak ki koleszterin enzimatikus meghatározására Mivel a koleszterin nagy része észterek formájában fordo! eiő biclógisi anyagokban, koleszterinészterdz és koleszterint oxidáló enzimek, például koleszterinoxidáz vagy koleszterindehidrogenáz, együttes használata lehetővé teszi koleszterin-észterek teljesen enzimatikus meghatározását is. Ez a 2 264 847 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli szabadalmi leírásból ismert. Különösen alkalmasnak bizonyult a koleszterinészteráz-meghatározás keretein belül a mikroorganizmusokból származó enzim (25 06 712.3 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beii nyilvánosságrahozatali irat). Az eddig felfedezett, feldolgozásra érdemes koleszterinészteráz-tartalommal rendelkező mikroorganizmusok hátránya azonban, hogy a kapott enzímaktívitás — kitermelés viszonylag alacsony. Meglepő módon azt észleltük, hogy bizonyos mikroorganizmusok alkalmazásakor sokszorosan nagyobb akti vitást érhetünk el, mint ami eddig lehetséges volt. A koleszterinészteráznak a Pseudomonas nemzetségbe tartozó mikroorganizmusok alkalmazásával való előállítására szolgáló találmány szerinti eljárást az jellemzi, hogy Pseudomonas sp. DSM 1280 vagy DSM 1281-et alkalmas táptalajon valamilyen induktor jelenlétében tenyésztünk, és az enzimet a fermentléből vagy/és a sejtekből kinyerjük. A 25 27 068 sz. Német Szövetségi Köztársaság-beli nyilvánosságrahozatali iratból ismeretesek már a Pseudomonas fluorescens nemzetség olyan törzsei, amelyek szintén feldolgozásra érdemes mennyiségű koleszterinészterázt tartalmaznak. Azonban ezekben az esetekben is kevés a kinyerhető aktivitásmennyiség, többnyire csak néhány egység,'liter. Ezzel szemben a találmány szerinti eljárásban alkalmazott mikroorganizmusokkal 15 000 és még több egység/liter aktivitást érünk ei. A találmány szerinti eljárás során olyan táptalajon tenyésztünk, amely valamilyen induktort tartalmaz. „lnduktor”-on itt olyan anyagot értünk, amely a mikroorganizmust arra serkenti, hogy a kívánt enzimet nagyobb mennyiségben termelje, mint induktor nélkül. A hozzáadott induktort előnyösen szénforrásként is, különösen egyedüli szénforrásként alkalmazzuk. Eljárhatunk azonban ügy is, hogy külön szénforrásokat, például kukorica áztatóvizet, peptonokat, élesztőkivonatot, valamint kevésbé alkalmasan cukrokat vagy poliaikoholokat, például glicerint adunk a táptalajhoz. Induktorként a palmitin-észterek — főleg a tripalmitin — bizonyultak igen megfelelőnek. A legjobb eredményeket azonban a lecitin induktorként való alkalmazásával értük el. Az alkalmazott különböző lecitinek közül különösen alkalmasnak bizonyult a szójalecitin, de más lecitinféleségek például a tojáslecitin vagy agyvelőlecitin — is nagyon jó eredményeket adtak. A hozzáadott induktormennyiség bizonyos fokig az alkalmazott induktor fajtájától függ, ez általában körülbelül 0,1 és 5 sűly% között van a táptalaj térfogatára számítva. Lecitinnek induktorként és egyedüli szénforrásként való alkalmazása esetén 0,5-2 súly%-nyi mennyiségnél kapunk különösen jó eredményeket. A táptalaj ezen túlmenően rendszerint még hozzáadott sókat és nyomelemeket is tartalmaz, és pH-ját alkalmas puffer hozzáadásával körülbelül 5 és 9, előnyösen 6 és 8 közé kell állítani. Pufféiként a foszfátpufíer előnyös. A táptalaj ezenkívül célszerűen még ammonium-, klorid-, vas-, réz-, cink-, magnézium- és kalciumionokat is tartalmaz, eUekintve a foszfátpuffer alkáliion- R j iiíól. Foszfát célszerűen 0,4 és 2 súly% közötti koncent- ; rációban van jelen, de nagyobb vagy kisebb koncentrá- : cióban is adható hozzá. j Állati zsírok, és meglepő módon koleszterin-észterek , is, a találmány szerinti eljárásnál induktorként kevésbé ; IQ bizonyultak előnyösnek. Egy, a találmány szerinti eljárás során előnyösen j rikalmazott táptalaj összetétele körülbelül a következő, j ■ liter folyadékra számítva: 5-10 g, előnyösen 6-8 g Na2 HP04 • 2 H2 O; 15 1 -5 g, előnyösen 2-4 g KH2P04 ; 0,2-2 g, előnyösen 0,8-1,2 g NH4Cl; j 0,01-0,1 g, előnyösen 0,3-0,7 g NaCl; 0,01 — 1 ml 1 %-os FeCl3 oldat; j 0,01 -1 ml 0 2 %-os CuC!2 oldat; 20 0,01—1 ml 1 %-os cink-szulfát oldat; : 0,1 ^10 ml 10%-osCaCl2 oldat; 1-20 ml, előnyösen 3-10 ml 12 %-os MgS04 oldat; 0,1—5 súly%, előnyösen 0,5—2 súly% szójalecitin. A tenyésztést aerob körülmények között végezzük., 25 Mind rázatott tenyészet, mind levegőztetett merített J tenyészet megfelelő. A hőmérséklet körülbelül 15 és j 45 °C között lehet, előnyösen 25—35 °C. Általában már; 1—2 napos tenyésztési időtartam után maximális enzim-,1 kitermelést kapunk. 0(1 r ° A találmány szerint használható mikroorganizmusok nagyon hasonlóak, és a következő jellemző tulajdonságokkal rendelkeznek: j Gram-negatív, j 35 obiigát aerob, sárgás telepek húspepton-agaron, növekedés 25,30 és 37 °C-on, ; nincs növekedés 10 °C-nál és 41 °C felett, sejtnagyság 0,8-1 n, 2-4 ju, 4Q motil, lofotrich ostoros, nem hajlamosak láncképzésre, nincsenek spórák vagy nyugalmi alakok, citokróm — oxidáz + kataláz (+) indol nitrit — Voges-Proskauer — zselatin-Monoszubsztrát lebontás adonit + citrát + galaktóz + glükóz + inozit + laktóz + mannit + niannóz + szalicin + szorbit + A koleszterinészteráz mind a fermentlében, mind á sejtekben jelen van. Felületaktív szerek, különösen nemjionogén szerek — amelyek előnyösen alkil- és aralkil-csojportokkal rendelkező polioxietilén-észterek és -éterek 65 típusához tartoznak - hozzáadásával a fermentlé és a sej-2
