183202. lajstromszámú szabadalom • Eljárás koleszterinészteráz előállítására

i 83 202

tek közötti megoszlási arány az extracelluiárts aktivitásnak az intracelluláfis aktivitás terhére vaió növekedése irányában befolyásolható, ionogen felületaktív szerek esetében a megoszlás változása fordított irányban megy végbe. 5

A tenyésztés befejezése után a koleszterinészterázt a sejtíömegből és/vagy a fennentlé szünetéből szokásos módon elkülönítjük, és adott esetben tisztítjuk. Sok célra azonban már tisztítatlan nyerstermék is megfelel, amely lényegében csak feltárt sejttömegből áll. Feltá- ,q rásra a szakemberek által már ismert módszerek alkalmasak, amelyek itt közelebbi magyarázatra nem szorulnak. Mind a fermentlé szűrletéből, mind a feltárt sejttömegből az oldatlan alkotórészek leválasztása után az enzimet szokásos lecsapószerekkel, például sókkal, így 15 ammónium-szulfáttal vagy szerves oldószerekkel, például acetonna! vagy etanollal csapjuk le, és utána a szokásos frakcionálási műveletek, például kromatográfia vagy kicsapás alkalmazásával tisztítjuk tovább.

A következő példák a találmányt részletesebben 20 szemléltetik.

A mélyhűtött ampullából, ferde táptalajról vett Pseudomonas spec. DSM 1280-at főtáptalajon két napig 30 °C-on aerob körülmények között (rázólombik) előtenyésztünk, és utána 10 %-nyi mennyiségben átoltjuk olyan táptalajra, amely literenként a következő alkotóré- 30 székét tartalmazza:

7g Na2 HFO4 ‘2 H20,

3 g KH2PO4,

1 gNH4CI,

0,05 g NaCl, 35

0,1 ml 1 %-os FeCl3oldat,

0,1 ml 0,2 %-os CuCl2 oldat,

0,1 ml 1 %-os ZnS04 oldat,

1.0 ml 10 %-os CaCl2 oldat,

5.0 ml 12 %-os MgS04 oldat, 40

1,5 % szójalecitin,

pH 7,0.

A tenyésztés 30 °C-on aerob körülmények között rázólombikban történik. 1—3 nap múlva körülbelül ^ 15 000 egység/liter aktivitást (felülúszó és biomassza; szubsztrát.koleszteril-oleát) kapunk.

Körülbelül ugyanilyen kitermelést kapunk, ha azonos körülmények között Pseudomonas spec. DSM 1280 helyett Pseudomonas spec. DSM 1281-et használunk. j-n

2, példa

Egy 1. példa szerint kapott fermentiébő! az oldatian sejt tömeget lecentrifugáljuk, és koleszterinészter áz meghatározást végzünk. A meghatározás a következő reakcióegyenletek szerint történik:

, . , . , , ,T ^ koi.-észteráz

1 kneszterin-eszter + H20----------------------»-koleszterin + zsírsav

2. koleszterin + 1/202

kel. oxidáz/ka taláz

koSesztenon + H202

(A kolesztenon-képződés mérése 240 nm-nél).

A méréshez a következő oldatokat használjuk:

1. 0,5 mólos, 7,5 pH-jú foszfátpuffer, 0,4 % Thesit (hidroxi-polietoxi-dodekán);

2. koleszterín-oleát c=4, Thesit/dioxán (hidrcxi-polietoxi-dodekán/dioxán), 1:1 arányú elegy;

3. kb. 0,6 mólos H202 (5 ml Perhydrol/T00 ml);

4. kataláz(0,01 mg protein/ml);

5. koleszterin-oxidáz (legalább 50 egység/ml);

6. fermentlé (körülbelül 5000 egység/liter esetén vízzel 1:5 arányban hígítva; vizsgálatra 0,01 ml).

A méréshez 2,95 ml 1. oldatot 0,02 ml 2. oldattal elegyítünk. 5 perc múlva 0,01 ml 6. oldatot és 0,02 ml

5. oldatot adunk hozzá, és 1 perc múlva a reakciót 0,1 ml 2. oldat hozzáadásával beindítjuk.

A számítást a következőképp végezzük:

3,12-5-1000

15,5-0,01

AE/perc = egység/liter fermentlé.

Szabadalmi igénypontok

!. Eljárás koleszterinészteráz előállítására a Pseudomonas nemzetséghez tartozó mikroorganizmusok segítségével, azzal jellemezve, hogy Pseudomonas sp. DSM 1280-at vagy DSM 1281-et alkalmas táptalajon valamilyen induktor jelenlétében tenyésztünk, és az enzimet kinyerjük a tenyészfolyadékból vagy/és a sejtekből.

?.. Az 1. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy lecitin induktor jelenlétében végezzük a tenyésztést.

3. A 2. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy szójaíecitint adunk a táptalajhoz.

4. A 2. vagy 3. igénypont szerinti eljárás foganatosítási módja, azzal jellemezve, hogy a tenyésztést 0,5— 2 sűly% lecitin jelenlétében végezzük.

5. Az előző igénypontok bármelyike szerinti eljárás fog matosítási módja, azzal jellemezve, hogy a táptalajhoz 0,4-2 súly% foszfátot adunk.

Ábra nélkül

3