183201. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológia eljárás kolánsav-származékok előállítására
1 183 301 A 2. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a lombikokat rázógépen, 24 órán át 30°C-on inkubáljuk. 98,0 g szilárd anyagot kapunk, amely a termékek és az át nem alakult kólsav elegye. Az elegy összetételét az 1. példában ismertetett nagysebességű folyadékkromatográfiás eljárással határozzuk meg. Az eredményeket az 5. táblázatban közöljük. 4. példa 5. táblázat Vegyület Részarány 3a,7a-Dihidroxi-12-keto-5|3-kolánsav 67,7 7a-Hidroxi-3,12-dike to-5/3-kolánsav 8,3 7a, 12a-Dihidroxi-3 -keto-5j3-kolánsav 4,0 Kólsav 20,0 10 15 20 J. példa A 2. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az egyes lombikokba 20-20 ml oltótenyészetet töltünk. Az oltótenyészetet 24 órán át 30°C-on végzett tenyésztéssel állítjuk elő. 117,0 g szilárd anyagot kapunk, amely kolánsav-származékok és át nem alakult kólsav elegye. Az elegy összetételét az 1. példában ismertetett nagysebességű folyadékkromatográfiás eljárással határozzuk meg. Az eredményeket a 6. táblázatban közöljük. 6. táblázat 25 30 35 Vegyület Részarány 40 3a,7a-Dihídroxi-12-keto-50-kolánsav 63,3 7a-Hidroxi-3,12-dike to-50-kolánsav 23,5 la, 12a-Dihidroxi-3-keto-5(3-kolánsav 2,0 45 Kólsav 11,2 6. példa 50 Arthrobacter CA-35-A589-29-32 (FERM-PNo. 5521, ATCC No. 31652) törzset tenyésztünk körülmények között : a következő A tápközeg összetétele: 55 Kólsav 100 g Ammónium-nitrát 2,0 g Kálium-dihidrogén-foszfát 2,0 g 60 Dikálium-hidrogén-foszfát 5,0 g Magnéziumszulfát-heptahidrát 0,2 g Élesztőkivonat 0,1g Nátriumhidroxid 10 g Glükóz 5,0 g Csapvíz q.s. ad 1 liter A tápközeg komponenseit — a glükóz kivételével - csapvízzel keverjük össze, az oldat térfogatát 800 ml-re állítjuk be, és az oldatot autoklávban 15 percig 120°C-on hőkezeljük. A glükózt 200 ml csapvízben oldjuk, és az oldatot autoklávban 30 percig 110°C-on hőkezeljük. Lehűlés után az oldatokat egyesítjük, és a kapott, 1 liter térfogatú fermentációs közeget egyenlő részletekben 10 db, egyenként 500 ml térfogatú Sakaguchi-lombikba töltjük szét aszeptikus körülmények között. Minden egyes lombikba 2 ml oltótenyészetet mérünk be. Az oltótenyészet előállítása során a törzset a fentivel azonos összetételű tápközegen rázás közben 14 órán át 30°C-on tenyésztjük. A lombikokat 3 napon át rázógépen, 30 °C-on inkubáljuk. A tenyésztési időszak végén a fermeníieveket egyesítjük, és a mikroorganizmus-sejteket centrifugálással eltávolítjuk. A felülúszót 600 ml 1 n vizes sósavoldattal megsavanyítjuk. A kivált csapadékot elkülönítjük, és az oldatot 1 liter etilacetáttal extraháljuk. Az extraktuinból forgó bepárlókészüléken lepároljuk az etilacetátot, és a maradékot egyesítjük az előzőekben elkülönített csapadékkal. 99,3 g szilárd anyagot kapunk, amely kolánsavszármazékok és kólsav elegye. A kapott elegy kis mintájából 2 %-os metanolos oldatot készítünk. 10 pl metanolos oldatot pBondapak C-18 oszloppal felszerelt nagysebességű folyadékkromatográfiás berendezésbe (HLC-GPC-244 típusú berendezés) fecskendezünk. Az oszlopot 1 ml/perc sebességgel 30:70 térfogatarányú víz : metanol eleggyel (pH = 4,0) eluáljuk, és mérjük az eluátum törésmutatóját. A kapott kromatogramot az 5. ábrán mutatjuk be. Az 5. ábrán megjelölt B és D csúcs megfelel a 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5/3-kolánsav, illetve a kólsav hiteles mintáján mért csúcsnak. A B csúcsnak megfelelő frakcióból elkülönítjük a terméket, és a termék szerkezetét tömegspektrum, infravörös spektrum és NMR-spektrum felvételével vizsgáljuk. A spektrumok adatai egyértelműen igazolják, hogy termékként 3a,7a-dihidroxi-l 2-keto-50-kolánsavat kaptunk. Az egyes termékek hozamát, valamint az át nem alakult kólsav mennyiségét az 5. ábrán bemutatott kromatogram alapján, az egyes görbeszakaszok alatti területek arányából számítottuk ki. Az eredményeket a 7. táblázatban közöljük. ' 7. táblázat Vegyület Konverzióarányi * Hozam, g 3a,7a-Dihidroxi-l 2-keto- 5j3-kolánsav (B csúcs) 98,85 98,16 Kólsavból képződő egyéb származékok 0,59 0,59 Kólsav (D csúcs) 0,56 0,56 65 *A konverzióarányt a ki. területarány alapján számítottuk 18
