183201. lajstromszámú szabadalom • Mikrobiológia eljárás kolánsav-származékok előállítására
1 7. példa 183 201 2 9. példa A 6. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a lombikokba a 6. példa szerint felhasznált 2 ml oltótenyészet helyett mikroorganizmus-sejt- ^ szuszpenziót adunk. A sejtszuszpenziót úgy állítjuk elő, hogy 10 ml oltótenyészetből centrifugálással elkülönítjük a sejteket, majd a sejteket 10 ml steril vízben szuszpendáljuk. Termékként 99,5 g szilárd anyagot kapunk, amely kolánsav-származékok és át nem alakult kólsav ^ elegye. Ezt a szilárd anyagot 270 ml metanolban oldjuk, és az oldathoz 9 ml tömény vizes sósavoldatot adunk. A kapott oldatot 20 percig visszafolyatás közben forralva a kólsavat és a fermentáció tennékeit a megfelelő inetilészterekké alakítjuk. ^ 1200 mm hosszú, 70 mm átmérőjű oszlopba 1500 g szilikagél C-2Ö0-at töltünk, és a fentiek szerint előállított metilésztereket a szilikagélen adszorbeáltatjuk. A géloszlopot 99:1 térfogatarányú kloroform : etanol eleggyel eluáljuk. 102,0 g 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5(3-kolánsavmetilésztert kapunk, amelyből hidrolízissel 98,5 g 3a,7adihidroxi-12-keto-5/3-kolánsavat állítunk elő. A 6. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy változtatjuk a kólsav koncentrációját, a fermentációs elegyhez a felhasznált kólsav mennyiségére vonatkoztatva 10 súly % nátriumhidroxidot adunk, és a csapadék leválasztása során 1 g nátriumhidroxidra 30 vonatkoztatva 60 ml 1 n vizes sósavoldatot használunk fel. A konverzió-arányokat, az elért hozamot, valamint az át nem alakult kólsav mennyiségét a 8. táblázatban tüntetjük fel. A 6. példában közöltek szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy az Arthrobacter CA-35-A589-29-32 törzs helyett Arthrobacter CA-35-A589-47 törzset (FERM-P No. 5523, ATCC No. 31653) használunk fel, 50 g/1 kólsavat és 5 g/1 nátriumhidroxidot adunk a fermentációs közeghez, és az egyes lombikokat 35 órán át 30°C-on inkubáljuk. 49,31 g szilárd anyagot kapunk, amely a fermentációs termékek és az át nem alakult kólsav elegye. Az elegyet a 6. példában közölt körülmények között nagysebességű folyadékkromatográfiás elemzésnek vetjük alá. A kapott kromatogramot a 6. ábrán mutatjuk be. A kromatogram A, B, C és D csúcs - hiteles mintákkal végzett összehasonlítás alapján - rendre a 7a-hidroxi-3,12-diketo-5(3-kolánsavnak, 3a,7a-dihidroxi-12-keto-5ßkolánsavnak, 7a,12a-dihidroxi-3-keto-5j3-kolánsavnak, illetve kólsavnak felel meg. Az A, B, C és D csúcsnak megfelelő frakciókat elkülönítjük, majd vékonyrétegkromatográfiának vetjük alá. A kromatográfiás elemzés szerint a B, C és D csúcsnak megfelelő frakciók egyetlen vegyületet tartalmaznak, míg az A csúcsnak megfelelő frakció a 7a-hidroxi-3,12- dikcto-5|9-kolánsav mellett egy azonosítatlan anyagot is tartalmaz. Az egyes termékek hozamát, valamint az át nem alakult kólsav mennyiségét a 6. ábrán feltüntetett kromatogram alapján, az egyes görbeszakaszok alatti területek arányából számítottuk ki. Az eredményeket a 9. táblázatiján közöljük. 8. táblázat Konverzióarány vagy hozam az alábbi szubsztrátumkoncentrációk esetén 3a,7a-Dihidroxi-l 2-keto- 5/3-kolánsav Kólsav 1 g/1 96,7 %* 0,4% 5 g/1 98,0 %* 0,7% 10 g/1 9,3 g 0,1 g 20 g/1 19,5 g 0,2 g 50 gA 49,6 g 0,1g 100 g/1 98,2 g 0,6 g 200 g/1 129,2 g 70,0 g *Konverzióarány 9. táblázat Vegyület Konverzióarány, % Hozam, g 7a-Hidroxi-3,12-diketo-5/3-kolánsav + egy azonosítatlan anyag (A csúcs) 0,80 0,39 3a,7o:-Dihidroxi-12-keto-5j3-kolánsav (B csúcs) 98,01 48,33 7a,12a-Dihidroxi-3-keto-5/3-kolánsav (C csúcs) 0,25 0,13 Egyéb származékok 0,24 0,12 Kólsav (D csúcs) 0,70 0,35 19
