183122. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikai eljárás rosszindulatú neoplazmák kimutatására
1 183 122 2 A találmány tárgya vizsgálati módszer rosszindulatú neoplazmák felismerésére. A rák felismerésére alkalmas új módszerekre nagy szükség van. A rák korai felismerése sok esetben nagymértékben jnegnöveli a betegség visszafordításának esélyeit. Az irodalomban megtalálhatók azoknak a kísérleteknek a leírásai, amelyek során megkísérelték bizonyos tumor-specifikus anyagok, például hormonok és antigének kimutatását a rákos beteg vérében. Ezek a kísérletek sikertelenek voltak, ezért a gyakorlatban használható, kíméletes, tumor-specifikus szérum-komponens koncentrációján alapuló diagnosztikai módszer napjainkig elérendő cél maradt. Mostanában neoplazmás, szisztémás lupus eritomatozusos és más gyulladásos rendellenességekben szenvedő betegek szérumában DNS-hez kötődő fehérjéket mutattak ki [lásd például FEBS Letters, 92 (2), 211—213, 1978, Europ. J. Biochem., 71, 1-8., 1976; Amer. J. Med., 65, 437-445, 1978.]. Ezen szérumfehérjék gyakorlatban használható diagnosztikai módszerhez szükséges megfelelő mérési módszerét nem dolgozták ki. Ezenkívül a leírt szérumfehérjék nem bizonyultak elég szelektívnek a rákszú'rési módszerben megkívánt mértékben. A jelen szabadalmi leírásban használt inhibitor szérumfehérjét az alábbi helyen ismerhetjük meg: The Pharmacologists (Abs.), 20 (3), 238, 1978. Az összefoglalás azonban nem utal arra, hogy a protein rákos és rákmentes betegekben különböző koncentrációban van jelen. A találmány tárgya eljárás az emberi rosszindulatú neoplazmák általánosan használt kimutatására. Részletesebben a találmány tárgya olyan diagnosztikai módszer, amelynek segítségével az emberi szérummintákban levő DNS-hez kötődő specifikus protein jelenléte alapján megállapítható a rosszindulatú neoplazmák létezése. A módszer alkalmas a rosszindulatú elváltozások korai kimutatására, és a kezelt rákos beteg betegségének időbeni változásának követésére. A találmány szerinti módszer azon a felismerésen alapul, hogy bizonyos, a továbbiakban inhibitor proteinnek nevezett, DNS-hez kötődő proteinek rákos betegek szérumában jelentősen kisebb koncentrációban vannak jelen, mint a rákmentesek szérumában. A találmány szerinti módszerrel pontosan meghatározzuk ezt a szérumfehérjét, és így gyors, kíméletes és pontos módszer áll rendelkezésünkre a rák jelenlétének kimutatására. A bleomicin-indukált PM-2 DNS (Pseudomonas bakteriofág kovalensen zárt kör alakú DNS-sel) degradációjának vizsgálata során felfedeztük az emberi szérumban a különleges, DNS-hez kötődő proteint. A humán szérum gátolja ezt a degradációt. Ennek természetének tanulmányozása során identifikáltuk a gátló vegyületet. Az a hipotézisünk, hogy a PM-2 DNS degradációjának gátlása szérumfehéije jelenlétére vezethető vissza, bebizonyosodott, mikor pronázzal való kezelést követően a gátló aktivitás megszűnt. Dezoxi-ribonukleáz I-gyel vagy hasnyálmirigy ribonukleázzal való emésztés nem befolyásolja a szérum gátló aktivitását. A kutyák és a borjak széruma nem gátol, nem gátol a humán albumin és az immunoglobulinok sem. A gátló proteint nem denaturáló körülmények között, molekulaszűrőkkel, dialízissel és Sephadex oszlopkromatográfiával tisztítottuk. A protein tisztulása jelentősen fokozódott, amikor DNS-hez kötöttük, a nem kötődő fehérjéktől elválasztottuk a DNS-protein-komplexet, végül karbamidos kezeléssel disszociáltuk a proteint a DNS-től. A nátrium-dodecil-szulfát-poliakril-amid gélelek troforézissel és izoelektromos fókuszálással több mint kétszeres tisztulást értünk el. A gélelektroforetikus izoelektromos fókuszálás szerint az inhibitor egy protein, amelynek molekulasúlya 64 000 dalton, pl-értéke 5,9. Ezt a fehérjét önkényesen X inhibitor proteinnek neveztük el. Az X inhibitor protein gátló hatását a DNS-hez kötődve fejti ki. A DNS-hez való kötődést agaróz gélelektroforézissel, a DNS-protein-komplex izolálásával, fluoreszcensz és cirkular dikroizmussal bizonyítottuk. Az X inhibitor protein természetének vizsgálata során azt tapasztaltuk, hogy a rákos betegek és a rákmentes betegek szérumában ennek a proteinnek a koncentrációja meglepő módon jelentősen különbözik. Ennek a jelentős megfigyelésnek az alapján dolgoztunk ki érzékeny és gyors módszert a humán szérumban levő X inhibitor protein meghatározására. A PM-2 DNS-t előzőleg arra használták, hogy spektrofotofluorometrikusan mérjék a bleomicin biokémiai aktivitását [Cancer Res., 38, 3322—3326, 1978]. A bleomicin hatásmechanizmusában a molekula DNS-degradáció képességének van szerepe, és a bleomicin hatására a PM-2 DNS-hez az etidium-bromid (2,7-diamino-10-etil-9-fenil-fenantridinum-bromid) kevésbé kötődik. így a bleomicin aktivitását meghatározhatjuk fluoreszcencia spektrofotométerrel. A fentiek szerint az X inhibitor protein gátolja a bleomicin indukált PM-2 DNS-degradációt. Ennek következtében a bleomicin aktivitásának meghatározására használt fluorometrikus mérést alkalmazhatjuk a humán szérumban levő X inhibitor protein koncentrációjának mérésére. Az X inhibitor protein koncentrációja alapján eldönthető, hogy a vizsgált személy rákos vagy sem. A találmány tárgya tehát módszer az emberi rákos elváltozások kimutatására. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy meghatározzuk a vizsgálandó szérum mintában jelenlevő, DNS- hez kötődő specifikus X inhibitor protein koncentrációját, és az így kapott koncentráció-értéket összehasonlítjuk nkmentes személyek szérumában levő normális X inhibi'or protein koncentrációval. Ha a normális koncentráció-értékhez képest jelentősen csökken az X inhibitor protein koncentrációja, úgy a vizsgált személy valószínűleg rákos. Nem a szérumban levő X inhibitor protein koncentrációjának meghatározására alkalmazott mérési módszer a találmány lényege, a találmány a legszélesebb értelemben arra vonatkozik, hogy az X inhibitor protein koncentrációjának (bár meghatározzuk) ismerete felhasználható többféle humán rák diagnosztizálására. A PM-2 DNS fluoreszcensz mérésének egyik előnyös módszerét megtaláljuk az alábbi folyóiratban: Cancer Res., 38, 3322-3326, 1976. A mérés azon alapszik, hogy az X inhibitor protein gátolja a PM-2 DNS jól ismert, bleomicin indukálta reakcióját. Ha ezt a mérést használjuk, az X inhibitor protein koncentrációját kényelmi szempontból ICSo-értékben adjuk meg, ahol az ICso -térték azt az X inhibitor protein koncentrációt jelenti, amelynél a PM-2 DNS bleomicin indukálta degradációja 50 %-kal csökken. Ezt az IC50 -értéket azután összehasonlítjuk a rákmentes személyek vizsgálatakor kapott normális IC5o -értékkel, és ha a normális értékhez képest 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
