183122. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikai eljárás rosszindulatú neoplazmák kimutatására
1 183 122 2 az ICso-érték jelentősen emelkedik, úgy valószínű a rák jelenléte. További lehetséges koncentrációmérési módszert ismertet a 4 270 924 sz. USA-beli szabadalmi leírás. Az alábbiakban megadjuk az X inhibitor protein PM-2 DNS fluoreszcencia mérés részletes leírását: A vizsgált személy szérumából kimérünk 50 jul-t, majd 9,5 pH-jű pufferral, bleomicinnel, PM-2 DNS-sel és 2-merkaptoetanollal elegyet készítünk. Általában 50 jul szérumot keverünk össze 450 /al, 35 mmól/1 bleomicint, 8,3 /amól/1 PM-2 DNS-t, 25 mmól/1 2-merkaptoetanolt és 9,5 pH-jú nátrium-borát puffert (0,015 mól/1 NaCl: 0,05 mól/1 nátrium-borát) tartalmazó eleggyel. A fenti reakcióelegyet 30 percen át 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 12,1 pH-jú denaturáló pufferban etidium-bromidot oldunk oly módon, hogy először 22 ßg etidium-bromidot oldunk 1 ml 12,1 pH-jú denaturáló pufferban, majd 0,1 ml ilyen oldatot 0,9 ml 12,1 pH-jú denaturáló pufferral hígítunk. A denaturáló puffer készítéséhez 0,09 mól/1 trinátrium-foszfátot, 0,01 mól/1 etilén-diamino-te.traacetátot és 0,01 mól/1 nátrium-kloridot elegyítünk, az elegy pH-ját pedig 0,15 mól/1 nátrium-hidroxiddal 12,1-re állítjuk be. 1 ml fenti etidium-bromidos elegyhez például 100 pl inkubált szérumos elegyet adunk. Az etidium-bromid: PM-2 DNS fluoreszcenciáját 530 nm gerjesztés és 590 nm kisugárzás mellett spektrofotofluorométerrel határozzuk meg. A háttérnél magasabb fluoreszcenciát a PM-2 DNS-hez kötődött etidium-bromid okozza, így egy adott kontroll reakcióhoz (a vizsgált mintához hasonló, de bleomicint nem tartalmazó minta) viszonyított fluoreszcencia változás lehetővé teszi a PM-2 DNS bleomicin indukálta degradációjának meghatározását. A fluoreszcencia értékekből a szérumban levő X inhibitor protein jelenlétéből adódó PM-2 DNS-degradáció %-os gátlása könnyen meghatározható. A szérummintában levő X inhibitor protein koncentrációját ezután az ismert Lowry-módszerrel (folin-fenol reagenssel) meghatározzuk [J. Biol. Chem., 193, 265 — 275 (1951)]. A PM-2 DNS degradációjának százalékos gátlását kivetítve az X inhibitor protein koncentrációjának log értékeire, könnyen megkapjuk az egyes szérum minták IC50- értékét. Amikor egy adott személy ICS0 -értékét kiszámítottuk, valószínűsíthetjük, hogy a vizsgált személy rákos vagy rákmentes. Nagyszámú egészséges (rákmentes) és különböző rosszindulatú neoplazmával rendelkező személy vizsgálatából kiderült, hogy az X inhibitor protein jelentősen alacsonyabb mennyiségben van jelen a rákos betegek szérumában. Az IC50-érték ily módon jelentősen magasabb a rákos betegeknél, mint az egészségeseknél. Az IC50 -értékben mutatkozó világosan értékelhető különbség egyszerű és pontos módszert biztosít a rák jelenlétének kimutatására és ez a jelen szabadalmi leírás alapja. A rákmentes személyek vérmintáinak vizsgálatakor kapott IC50-értékek személytől függően bizonyos mértékig változnak. A mostani időkig vizsgált személyek ICso-értéke 90,2±11,0 /ug/ml (szignifikáns 0,001 értéken). Egészséges ember legmagasabb mért IC50-értéke 120 jug/ml. Rákos személyek IC50 -értéke a betegséget okozó ráktól függően változik, de mind-a mai napig értéke szignifikánsan nagyobb, mint a rákmentes személyeké. Rákos beteg legalacsonyabb mért ICS0-értéke 270 jug/ml. Ugyanakkor 200-nál magasabb ICS0-érték azt jelenti, hogy a vizsgált személynek nagy valószínűséggel valamilyen lípusú rosszindulatú neoplazmája van. A találmány szerinti eljárást különböző rákfajták kimutatására használtuk fel, ezért úgy gondoljuk, hogy általánosan felhasználható a rák diagnózisára. A kimutatott 'umorfajták között például az alábbiak szerepeltek: tesztikuláris karcinoma, limfoma, leukémia, a mell adenokarcinomája, a tüdő kis sejtjeinek adenokarcinomája, a tüdő nagy sejtjeinek adenokarcinomája, a bél adenokarcinomája és a melanoma, hogy csak néhányat említsünk A módszer specifikus a rák diagnózis szempontjából, mivel különböző nem neoplazmikus betegségben szenvedő rákmentes betegek IC50-értéke nem emelkedett. A fentiekben ismertetett X fehérje fluoreszcencia mérése az inhibitor azon különleges sajátságán alapszik, hogy gátolja a bleomicin által indukált PM-2 dezoxi-ribonukleinsav degradációt. A módszerrel meghatározott szérumban levő protein-koncentráció összefüggésben van a rosszindulatú betegség létezésével vagy hiányával. Ha tisztított X inhibitor protein áll rendelkezésünkre, úgy más, a biokémiában és a klinikai kémiában ismert más módszerek is kidolgozhatok mérésére. Ezek között a legfontosabbak az immunológiai módszerek, például a radio immunmérés, fluoro immunmérés, enzim immunmérés (például ELISA), spin-immunmérés, kemilumineszcencia immunmérés, fluororeszcens polarizációs imminmérés, nefelometria, géldiffúziós módszerek, továbbá a klasszikus módszerek, mint a hemagglutináció és komplementer fixálás. Az X inhibitor protein más funkcionális tulajdonságai is felhasználhatók a biológiai folyadékokban való mérésére. A molekulával összefüggő katalitikus jelenségek spektrofotometriás vagy spektrofluoiometriás, kinetikus vagy végpont méréssel is mérhetők. Ezen felül felhasználhatók a kérdéses biológiai folyadékból a különböző elkülönítési technológiák, és ezután a protein mennyiségi meghatározására különböző kimutatási módszerek használhatók, például spektrális vagy denzitometriás módszerek és immunológiai mérések. Mivel az előzőekben ismertetett módszerekkel az X inhibitor protein koncentrációja specifikusan mérhető, a módszerrel meghatározott szérum-koncentráció jelzi a rosszindulatú elváltozás jelenlétét vagy hiányát. Az X inhibitor protein tisztítását az alábbiak szerint végezzük. 1. példa Részleges tisztítás: A eljárás Az X inhibitor proteint Sephadex oszlopkromatográfiával részlegesen tisztítjuk. Egy ml humán szérumot 88 cmX2 cm méretű Sephadex G-75 gyantából készüli oszlopra juttatunk, az eluálást 0,07 mól/1,6,8 pH-jú nátrium-foszfát pufferral végezzük, szobahőmérsékleten óránként 6-8 ml-es sebességgel. Az inhibitort tartalmazó frakciókat összegyűjtjük, fagyasztva szárítjuk, és 1 ml vízben reszuszpendáljuk, majd 24 órán át 4 °C hőmérsékleten hússzoros térfogatú vízzel szemben dializáljuk. Ezután a fenti pufferral kiegyensúlyozott Sephadex G-200 gyantából készült oszlopra juttatjuk. A Sephadex G-200 gyantából készült oszlopról eluálva a proteint, három csúcsot kapunk 280 nm hul5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
