183101. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vegyi anyagok mutagén hatásának kvantitatív jellemzésére in vitro körülmények között végzett vizsgálattal
1 183 101 2 A találmány tárgya új eljárás vegyi anyagok mutagén hatásának kvantitatív jellemzésére in vitro körülmények között végzett vizsgálattal. A vegyi anyagok káros (elsősorban mutagén és karcinogaén) hatásának felderítésére a jelenlegi álláspont szerint a célszerű eljárás egy háromlépcsős szűrőrendszer kivitelezése lenne (Bridges: Mutat. Rés. 26, 335-340(1974)), amely három különböző organizációs szintre vonatkozik. A gyakorlatban azonban általában a három közül egy, esetleg két szinten szoktak szűrést végezni. Az első lépcsőt az in vitro körülmények között végzett szűrővizsgálatok jelentik, amelyekben a vizsgált vegyi anyagok mutagén hatásáról nyernek többé-kevésbé megbízható, közelítő információt. A vegyi anyagok karcinogén (és teratogén) hatásának felderítésére ez a vizsgálati szint a felhasznált vizsgálati szervezetek (mikroorganizmusok) alacsonyrendű volta miatt nem alkalmas; az általános biológiai ismeretek alapján azonban igen nagy valószínűsége van annak, hogy az in vitro körülmények között mutagén hatással rendelkező anyagok magasabbrendű szervezetekben karcinogén (vagy teratogén) hatást fognak kifejteni. Ezért azokat a vegyi anyagokat, amelyek az in vitro vizsgálatokban mutagéneknek bizonyultak, in vivo körülmények között végzett szűrővizsgálatoknak rendszerint már nem is vetik alá, hanem egyértelműen ártalmasnak minősítik. Az in vivo körülmények között végzett szűrővizsgálatok feladata az, hogy karcinogén hatás szempontjából tegye vizsgálat tárgyává az állati anyagcsaere esetleges aktiváló hatását azokra a vegyszerekre, amelyek az in vitro körülmények között végzett vizsgálatokban inaktívnak (ártalmatlannak) bizonyultak. Noha előfordulhat az az eset is, hogy az in vitro körülmények között végzett vizsgálatokban mnutagénnek bizonyult vegyszerek éppen az állati szervezetben végbemenő anyagcsere-folyamatok (például lebomlás) révén veszítik el káros hatásukat, ezeket a vagyszereket - miként már említettük - in vivo körülmények között általában már nem vizsgálják. Az in vivo vizsgálatok magasabbrendű szervezeteket (laboratóriumi kisállatokat) és rendszerint hosszadalmas kísérleteket igényelnek, így lényegesen költségesebbek az in vitro vizsgálati módszereknél. A szűrővizsgálatok harmadik lépcsőjét a humán vizsgálatok képezik. Ezekre a vizsgálatokra akkor kerül sor, ha a vegyszer alkalmazásával járó kockázat mértékét kívánják meghatározni olyan esetekben, amikor a vegyszer az előző két szűrővizsgálatban ártalmatlannak bizonyult, vagy a két szűrővizsgálat valamelyikében ártalmasnak mutatkozott ugyan, de használata elkerülhetetlen. Ezeket a vizsgálatokat rendszerint emberi szövettenyészeten kell elvégezni, így érthető módon igen költségesek. Miként az előzőekből kitűnik, a vegyi anyagok felhasználhatóságának meghatározása szempontjából alapvető jelentősége van az in vitro körülmények között végzett vizsgálatoknak. Ha ezek a vizsgálatok nem szolgáltatnak megbízható eredményeket, vagy nem alkalmasak a vizsgált vegyi anyag megfelelő jellemzésére, előfordulhat, hogy értékes anyagok további vizsgálatát vagy felhasználását mellőzik, illetve csak bonyolult és költséges további vizsgálatokkal tudják kimutatni azt a káros hatást, amelynek már az in vitro vizsgálatokban is jelentkeznie kellett volna. A megbízhatóság és megfelelő értékelhetőség mellett az in vitro körülmények között végzett vizsgálatokkal szemben támasztott további követelmény az, hogy egyszerűen, gyorsan és olcsón végrehajthatók legyenek; napjainkban ugyanis kívánatos volna, hogy ilyen szűrést ne csak a gyógyszerekre, hanem az iparban, a mezőgazdaságban, a háztartásokban stb. előforduló összes vegyszer vizsgálatára alkalmazzanak. Az ismert in vitro vizsgálati módszerek általában mikroorganizmusok (rendszerint baktériumok) mutációját tanulmányozzák. Az ilyen típusú eljárások között viszonylag gyakran alkalmazzák az ún. Ames-tesztet (Ames és munkatársai: Proc. Natl. Acad. Sei. (USA) 70, 2281 (1973)), amelynek során Salmonella typhimurium auxotróf mutánsait kezelik a vizsgálandó vegyszerrel, és a vegyszer által előidézett reverziót vizsgálják. Hasonló elven alapulnak a más szerzők által más objektumokon (pl. E. coli mutánsok, S. cerevisiae mutánsok stb.) kidolgozott eljárások is (Pueyo: Mutat. Rés. 54, 311 (1978) ; Glatt és munkatársai: Mutat. Rés. 66, 307 (1979) ); 66, 329 (1979)). Az eljárások közös hátránya, hogy a vizsgálatok legtöbbször csak igen-nem választ adnak az anyag mutagén hatásáról, de a hatás erősségét mennyiségileg nem jellemzik, tehát nem értékelhetők megfelelően. Hátrányt jelent az is, hogy a megfelelő auxotróf mutáns baktériumtörzsek fenntartása viszonylag költséges, munka- és szakértelemigényes feladat. Ezek az eljárások a mutagén hatás megállapítására rendszerint csak a folyamat végeredményét használják fel, a vizsgált vegyszer mutagén hatásának kinetikájával (azaz időbeli lefolyásával) azonban nem foglalkoznak. Az in vitro körülmények között fellépő mutagén hatások kvantitatív jellemzése a próbálkozás állapotában van. Glatt és munkatársai (Mutat. Rés. 66, 307 (1979)) önkényes mutagenitási indexet vezettek be, amelynek számítása során a négy Salmonella-mutáns közül (TA 1535, TA 1537, TA 98 és TA 100) érzékenynek talált három törzsön (TA 100, TA 98, TA 1537) mért mutagén hatást (azaz 1 nmól vegyszer által okozott revertáns kolóniaszám-növekedést a spontán revertált kolóniaszámhoz képest) különböző faktorokkal szorozzák, és a kapott szorzatokat összegzik. Ez a módszer tehát lényegében csak abban tér el a korábbiakban ismertetett kvalitatív jellemzési módszerektől, hogy a vegyszer mutagén hatásának kvalitatív értékelésére alkalmas adatokat önkényesen átalakítja, és ezáltal ugyan jobban kezelhetővé teszi, de ez az átalakítás nem rendelkezik semmiféle elvi alappal, teljesen formális. Könnyen belátható, hogy ez a főként kvalitatív adatokon alapuló eljárás nem szolgáltathat megbízható, kvantitativ értékeket a mutagén hatás jellemzésére. Találmányunkkal a fenti módszerek felsorolt hiányosságait kívánjuk kiküszöbölni. A találmányunk szerinti eljárásban vizsgálati anyagokként olyan fágokat alkalmazunk, amelyek lizogén gént nem tartalmazó, kettősláncú DNS-sel rendelkeznek. Ezekben a fágokban korábbi vizsgá5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 2
