183101. lajstromszámú szabadalom • Eljárás vegyi anyagok mutagén hatásának kvantitatív jellemzésére in vitro körülmények között végzett vizsgálattal
1 183 101 2 lataink szerint egyetlen pirimidin-rész dimerizációja már az egész fág pusztulását okozza. A baktériumokban ezzel szemben a mutáns reverziójának kiváltásához esetleg több, vagy kiterjedtebb, pontosan nem ismert kémiai változásnak kell létrejönnie egyetlen objektumon belül. Ennek következtében a részleges változást tartalmazó baktériumok a vizsgálat értékelésekor épeknek tűnhetnek fel. A fágok tehát - a baktériumokkal ellentétben - megbízhatóan jelzik már az első károsodást. Ezek a fágok — a többi fágokhoz hasonlóan - gazdasejtek távollétében életfunkciókat nem fejtenek ki, így azzal a veszéllyel sem kell számolnunk, hogy a károsító kémiai reakció lezajlása után a vizsgálati objektum biológiai reakciók révén regenerálódik, és a végső értékelésben épnek mutatkozva hamis eredményt jelez. A fágok további kedvező tulajdonsága, hogy pufferoldatokban (pH: kb. 7,0) hűtőszekrényben bármiféle külön kezelés (pl. levegőztetés, táptalajadagolás, átoltás stb.) nélkül gyakorlatilag korlátlanul eltarthatok, így fenntartásuk és felhasználásuk lényegesen egyszerűbb és olcsóbb, mint a mikroorganizmusoké. Bakteriofágokat már korábban is alkalmaztak és jelenleg is alkalmaznak egy-egy vegyszer vagy vegyszer-csoport hatásmechanizmusának tanulmányozására. Detektálásra a vegyszer mutagén hatását használják fel, azaz azt vizsgálják, hogy a vegyszer milyen elváltozást okoz a fágokon (Szpecificsnoszty khimicseszkovo mutageneza, Nauka, Moszkva, 1968 76-80. és 80 — 84., Biochim. Biophys. Hung. 10, 115- 120 (1975), J. Virol. 19, 318-324 (1976) és 24, 716-719 (1977), Biochem. Biophys. Acta 546, 495-506 (1979)). Ezek a munkák nem tűzték ki azt a célt, és az eredmények sem arra irányulnak, hogy segítségükkel mutagenitási tesztet dolgozzanak ki. Kifejezetten fág-mutagenitáson alapuló tesztelő eljárást a páros T-fágokkal (T2, T4) kapcsolatban javasoltak az irodalomban. Japán szerzők (Ikeda, Lijima: J. Gen. Appl. Microbiol. 11, 129-135 (1965)) a T2 tagokat alkalmazták. A módszer a vad típusú T2 fág (T2h + ) E. coli B/2 gazdasejtre specifikus mutációját (T2h) használja fel a vegyszerek mutagén aktivitásának szűrésére. A módszer az elmúlt 15 évben nem terjedt el a gyakorlatban. Ennek az alábbi elvi, illetve gyakorlati okai vannak: a) A T2 fág nukleinsava — nagyságrendjét tekintve - 10a mólsúlyú. Ebből a nagyméretű nukleinsavból a h+ -* h mutációban nyilván igen kis rész, azaz csupán néhány gén vesz részt. Kicsi tehát annak a valószínűsége, hogy a T2 fág-genomból a vegyszerrel éppen a teszteléshez kiválasztott mutációt okozó gén (gének) és csakis azok lépjenek kölcsönhatásba. Ez a körülmény a módszer érzékenységét jelentősen csökkenti. b) Ugyanezzel a körülménnyel függ össze az a tény is, hogy a letális mutáció (azaz a fáginaktiváció) valószínűsége a tesztelésre használt mutáció valószínűségénél lényegesen nagyobb. így az anyag hatására létrejövő fágpusztulás el is fedheti a kiválasztott mutáns keletkezését. Ez a jelenség különösen nagy mutagén anyag-koncentrációknál jelentkezhet. c) Az idézett módszer gyakorlati kivitelezésével kapcsolatos hátrány az is, hogy a mutagén vegyszert közvetlenül a baktérium-fág komplexhez adagolja, emiatt annak baktericid hatása érvényesülhet, és a gazdabaktériumok növekedését gátolhatja, ami esetleg meghiúsítja a kiértékelést is. A A,-fág-indukción alapuló, az irodalomban indukttesztnek nevezett eljárás kapcsolódik még fágokhoz (J. Gen. Appl. Microbiol. 11, 129-135 (1965), Proc. Natl. Acad. Sei. 73 , 3700 - 3704 (1976)). Ez a módszer azonban már elviekben is eltér az előzőektől annyiban, hogy a mutagén anyag a teljes (lizogenizált) baktérium-kromoszómával lép kölcsönhatásba. A mutagén anyag által okozott DNS-sérülés vált ki azután olyan anyagcsere-változást, ami a 7,-profág indukciójához vezet. Az indukttesztben tehát a fágok megjelenése csupán indikátora a mutáció fellépésének, de a mutagén hatás nem közvetlenül a fágokra irányul. Az alapmódszerrel kapcsolatos probléma az, hogy az eljárás kevéssé érzékeny, azaz nagy mutagén anyag-koncentráció szükséges az indukció kiváltásához (J. Gen. Appl. Microbiol. /7,129 -135 (1965)). Mint minden, nem-Ietális mutációt vizsgáló eljárásban, a vizsgálni kívánt vegyszer ebben az esetben is kifejthet a profág-indukció mellett károsító hatásokat. E hatás egyrészt közvetlenül a fágra, másrészt a lizogenizált gazdabaktériumra irányulhat. Az első esetben a fág inaktiválódik, a második esetben pedig a sejt fágprodukciós képessége csökken. Mindkét említett hatás főként nagy mutagén anyag-koncentrációknál várható, és elfedheti a profág-indukciót. Ezáltal a teszt hamisan negatív eredményt adhat. Az idézett módszerek közös hiányossága, hogy a mutagén hatás kvantitatív értékelésére csak nagyon kezdetleges és önkényes módot választanak. A jellemzés alapján csupán pozitív (enyhén vagy erősen), illetve negatív döntés hozható. Egy ilyen, lényegében kétfokozatú skála egyáltalán nem tükrözi azt a tapasztalatot, hogy a vegyszerek mutagén/karcinogén hatásának erősségi skálája 6-7 nagyságrendet ölel fel (J. Toxicol. Environm. Health 6, 1133- 1177 (1980)). Korábbi vizsgálataink során (Studia Biophys. 33, 121 (1972)) a T7 fágok ultraibolya fény okozta inaktiválódásával foglalkoztunk. Jelenlegi kísérleteink során, a fenti fágok vegyszerek hatására bekövetkező inaktiválódásának időbeli lefolyását vizsgálva megállapítottuk, hogy megadható az az idő, amely alatt egy adott vegyszer a vizsgált koncentrációban ugyanolyan mértékű fágpusztulást hoz létre, mint az az ultraibolya fény, amely a fágpopulációban átlagosan 1 pirimidin-dimért (a továbbiakban: dimért) kelt. Találmányunk azon a (elismerésen alapul, hogy a vegyszer koncentrációjának és az említett pusztulást okozó hatás idejének szorzata állandó érték, és kvantitative jellemzi az adott vegyszer mutagén hatását. A találmány tárgya tehát új eljárás vegyi anyagok mutagén hatásának kvantitatív jellemzésére in vitro körülmények között végzett vizsgálattal. A találmány értelmében úgy járunk el, hogy egy lizogén gént nem tartalmazó kettősláncú DNS-sel rendelkező fág (előnyösen T7 fág) statisztikus kiér5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 3
