183078. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens a koleszterin-észteráx aktiválására
1 183 078 2 Az indikátoroldat először szabad koleszterint kolesztenonná és hidrogén-peroxiddá alakít. A keletkezett hidrogén-peroxid fenollal és 4-amino-antipirinnel vörös szinezékké reagál, amelynek abszorpcióját fotometriásan mérjük. A keletkezett színezék mennyisége a szabad koleszterin koncentrációjával arányos. A szabad koleszterin-részből valamint az észteráz által szabaddá tett koleszterinből tevődik össze. A rekcióedényben levő elegy. 0,5 ml szubsztrát (kontroll-szárum; 360 mg/dl összkoleszterin); detergens, kísérlet szerint; adjuváns, kísérlet szerint; puffer, 5 ml-re. Indulás 50 Ml észteráz-törzsoldattal, amikor 0,003 egység/ml észteráz van a reakcióelegyben. Aktivitássorozatoknál ezt a mennyiséget változtatjuk. Sikeres indulás és összekeverés után a (2) szivattyú járatása közben a (3) szállítócsövet körülbelül 10 percre az (1) reakcióedényben levő oldatba mártjuk. Végül a jelek jobb elválasztása céljából körülbelül 10 részletben felváltva levegőt és kétszer desztillált vizet szivatunk be. Ezután következhet az újabb meghatározás. A következő példák az enzim találmány szerint lehetséges megtakarítását (a), megadott körülmények között nagyobb reakciósebességek elérését (b), kisebb ionerősségű pufferok alkalmazását (c), detergensek kisebb koncentrációban való alkalmazását (d) és olyan detergensek alkalmazását szemléltetik, amelyek meghatározott körülmények között csak elégtelen vagy egyáltalán semmilyen aktiváló hatást sem mutatnak (e). a) Koleszterin-észteráz megtakarítása. ezen sebességhez szükséges 0,0044 egység/ml enzimmennyiség adjuváns nélkül, elért aktivitás 5 1.2. 0,4 térf% 4-metil-: Bevitt aktivitás elért sebesség ezen sebességhez g szükséges enzimmennyiség adjuváns nélkül Elért aktivitás 147 %. •pentanol hozzáadása. 0,003 egység/ml; 0,065 extinkció/10 perc; 0,0063 egység/ml, 210%. 1.3. 1 térf% ciklohexanol hozzáadása. 20 Bevitt aktivitás elért sebesség ezen sebességhez szükséges enzimmennyiség adjuváns nélkül Elért aktivitás 0,0030 egység/ml; 0,077 extinkció/10 perc; 0,0075 egység/ml. 250 %. 25 2. példa 1,5 % Tergitol NPX 0,1 mólos 7,0 pH-jú kálium-foszfát pufferban. 30 Bevitt aktivitás 0,0012 egység/ml 0,0030 egység/ml 0,0060 egység/ml 35 0,0090 egység/ml 0,0120 egység/ml Elért sebesség 0,019 extinkció/10 perc 0,030 extinkció/10 perc 0,055 extinkció/10 perc 0,091 extinkció/10 perc 0,0120 extinkció/10 perc A koleszterin-észteráz megtakarításának lehetőségét a következőképp mutatjuk be: Először enzimaktivitás sorozatmeghatározást végzünk 4q adjuvánsok nélkül. Az összehasonlító mérések után a meghatározások adjuvánsok hozzáadása közben 0,003 egység/ml koleszterin-észteráz jelenlétében történnek. A bevitt aktivitás és az eredményezett sebesség között kimutatott összefüggés alapján határozzuk meg azután 45 az elért aktivitásnövekedést. 0,4 térf% 2,2,2-triklór-etanol hozzáadása. 2.1. Bevitt aktivitás Elért sebesség ezen sebességhez szükséges enzimmennyiség adjuváns nélkül Elért aktivitás 0,003 egység/ml 0,046 extinkció/10 perc 0,0046 egység/ml 153%. 1. példa 0,1 mólos trisz/borkősav puffer, pH 8,0; 5 %0 Triton X-100. Bevitt aktivitás 0 egység/ml 0,0012 0,0030 0,0045 0,0060 0,0089 1.1. Bevitt aktivitás elért sebesség elért reakciósebesség 0 extinkció/10 perc 0,012 0,032 0,052 0,058 0,094 0,0030 egység/ml; 0,046 ext./10 perc; 2 térf% terc-amilalkohol hozzáadása. 2.2. 2 térf% terc-amilalkohol hozzáadása. Bevitt aktivitás 30 Elért sebesség ezen sebességhez szükséges enzimmennyiség adjuváns nélkül 33 Elért aktivitás 2.3. 1,4 térf% 4-metil-Bevitt aktivitás 60 Elért sebesség ezen sebességhez szükséges enzimmennyiség adjuváns nélkül 65 Elért aktivitás 0,003 egység/ml 0,053 extinkció/10 perc 0,0053 egység/ml 177%.-pentanol hozzáadása. 0,003 egység/ml 0,059 extinkció/10 perc 0,0059 egység/ml 197%. 4
