183078. lajstromszámú szabadalom • Eljárás és reagens a koleszterin-észteráx aktiválására
1 183 078 2 például a mono-, di- és triklór-fenol. A halogénatommal többszörösen szubsztituált alifás alkoholok közül például diklór-etanol, triklóretanol, diklór-metanol, triklór-metanol, triklór-propanol, tetraklór-propanol stb. használható. Halogén-szubsztituensekként az aromás és 5 alifás alkoholok esetében a klór-, bróm és fluoratom jön számításba, előnyösen a klóratom. Előkísérletekkel könnyen eldönthető, hogy ezek közül az alkoholok (a továbbiakban adjuvánsok) közül egy bizonyos esetben melyek különösen alkalmasak. 10 A körülmények, így a pufferrendszer fajtája és erőssége, a detergens fajtája és koncentrációja, valamint a reakcióelegy tárolhatósága és a tárolható forma kívánt konzisztenciája többnyire előre megadottak. Ezekhez a feltételekekhez igazodhatunk azután az alkalmas adjuváns 15 kiválasztásával és a hozzáadandó mennyiség egyeztetésével. Általában azt észleltük, hogy literenként 1 és 300 mmól közti adjuváns mennyiség esetében kapunk jó eredményeket. Folyékony alkoholok esetében előnyösen 0,01 és 5 20 térfogat% közötti, szilárd alkoholok esetében 0,01 és 5 súly% közötti mennyiségeket adagolunk. Különösen előnyös 0,05-tól 3 %-ig terjedő mennyiség. A polietoxi-származékokban az alkilcsoportok általában 8—18 szénatomot, az alkil-fenil-csoportok előnyö- 25 sen egy fenilcsoportot tartalmaznak. A detergensekben a glikol-maradék általában 3—25 etoxi-csoportot tartalmaz. A detergenseket célszerűn 0,05 és 5 térfogat%, illetve szilárd anyagok esetében súly% mennyiségben alkalmaz- 30 zuk. Előnyös 0,1-ől 3 %-ig terjedő mennyiség. A találmány tárgya továbbá a koleszterin-észteráznak iontartalmú oldatokban való aktiválására szolgáló reagens, amelyre az jellemző, hogy legalább egy (3-25 etoxi-csoportot tartalmazó)-polietoxi-(6—11 szénatomos) 35 alkil-fenil-étert, vagy (3—25 etoxi-csoportot tartalmazó)polietoxi-(8—18 szénatomos ) alkil-étert, vagy 1 -3-(3— 25-etoxicsoportot tartalmazó)-polietoxicsoporttal szubsztituált cukoralkoholok 8—18 szénatomos zsírsavakkal alkotott észterét és/vagy epesav-származék és/ 40 vagy 6—10 szénatomos zsírsav-alkálifémsó típusú felületaktív szert tartalmaz, valamint egy szinergikus hatású alkoholt, amelyet az 5—8 szénatomos egyeneslácú vagy elágazó láncú vagy ciklikus alifás alkoholok, adott esetben 1—3 halogénnel szubsztituált fenol, 1—2 hidroxíl- 45 csoporttal szubsztituált naftalin vagy 1—3 szénatomos, 1—4 halogénnel szubsztituált alifás alkoholok közül választunk ki. A találmány alkalmazható mindenféle olyan méréssel és reakcióval kapcsolatban, amelynél koleszterin- 50 észterázt használunk a reakcióelegyekben. Ilyenféle reakcióelegyeket a szakemberek általában ismernek, és — amennyiben analitikai célokat, szolgálnak — például H. U. Bergmeyer: Methoder der enzymatischen Analyse (Verlag Chemie Weinheim, Bergstrasse) c. könyvében 55 írnak le ilyeneket. Ezért ilyenfajta reakcióelegyek közelebbi taglalása itt felesleges. A találmány alkalmazásával lehetővé válik, hogy enzimet takarítsunk meg, adott körülmények között nagyobb reakciósebességeket érjünk el, kisebb ionerősségű pufferokat használjunk, 60 detergenseket kisebb koncentrációban alkalmazzunk, és olyan detergensek is alkalmazhatók, amelyek egyedül nem kielégítő vagy egyáltalán semmilyen aktiváló hatást nem mutatnak. Á találmány alkalmazható mikroorganizmusokból származó vagy más eredetű, például hasnyál- 65 mirigyből vagy májból származó koleszterin-észteráz használata esetén is. A következő példák a találmányt részletesebben szemléltetik a mellékelt rajzok segítségével. Ezek a következőket ábrázolják: 1. ábra: A koleszterin-észteráz aktivitásának meghatározására használt berendezés vázlatos ábrázolása. 2. ábra: Az alkalmazott módszernél fellépő időegységenkénti extinkcióváltozás grafikus ábrázolása, amelyet az észterhasítás sebességének meghatározására használunk. A következő táblázat a kereskedelmi néven említett detergensek kémiai összetételét közli: Brij 35 Genapol OX-100 Tergitol NPX Thesit Triton X-100 Tween 20 polietoxi-lauril-éter; polietoxi-zsíralkohol-éter; polietoxi-nonil-fenil-éter (körülbelül 10,5 etoxi-csoport); hidroxi-polietoxi-dodekán-éter; polietoxi-oktil-fenil-éte r (9—10 etoxi-csoport); polietoxi-szorbitán-monolaurát. A találmány szerinti vizsgálandó szinergikus kombinációk koleszterin-észterázra gyakorolt aktiváló hatásnak mérésére az 1. ábrán bemutatott berendezést használjuk. Egy 25 °C-on temperált (1) reakcióedényből, amelyben az észterhasítás végbemegy, egy (2) csöves szivattyúval és meghatározott keresztmetszetű (3) szállítócsövön át percenként folyamatosan 0,32 ml elegyet veszünk el. Ugyanezzel a szivattyúval egy (4) második csövön át egy (5) tárolóedényből szintén folyamatosan percenként 1,0 ml indikátoroldatot továbbítunk, a (2) szivattyú után 0,6 ml/perc állandó (6) légáramot vezetünk hozzá, megkeverjük, és utána az előbbi reakcióeleggyel egyesítjük. Az együttes áramot utána átvezetjük két (7) üvegcsövön, miáltal elérjük a folyadékok alapos átkeverését, és az indikátorreakció végbemeneteléhez szükséges reakcióidő eltelik. Közvetlenül a küvetta előtt a (8) csővezetéken 1,2 ml/perc áram elvételével a légbuborékokat ismét eltávolítjuk. A maradék áramot fotometriás mérésre (546 nm-nél) egy 1 cm rétegvastagságú átfolyó küvettába vezetjük, és a mérési eredményeket a (10) írószerkezettel rögzítjük. Az indikátorreakció állandósított feltételei miatt a mérőjel nagyságában és lefutásában fellépő változások egyedül a reakcióedényben végbemenő folyamatoktól függenek. Ha ott észterhasítás megy végbe, úgy ennek kinetikus lefutása a mérőjel növekedését eredményezi, amelyet a (10) írószerkezet pozitív növekedésként jegyez fel. A növekedés meredeksége a reakciósebesség mértéke, és így mérték a koleszterin-észteráz aktivitására a reakcióelegyben. Az észterhasítás és az indikátorreakció elkülönített lefolyása miatt ellenkező befolyásolás ki van zárva. Természetesen más indikátorrendszerek is alkalmazhatók lennének, beleértve az oxigénelektródot is. Indikátoroldat : 0,1 mól kálium-foszfát puffer; pH = 7,0; l,5mmól/lit. 4-amino-antipirin; 5 mmól/lit. fenol; 3 %o hidroxi-polietoxi-dodekán; 8 egység/ml peroxidáz; I egység/ml koleszterin-oxidáz. 3
