182641. lajstromszámú szabadalom • Diagnosztikai eszköz a glükóz kimutatására és meghatározására
182 641 A találmány tárgya diagnosztikai eszköz a glükóz kimutatására és meghatározására testfolyadékokban. A glükóz kimutatására szolgáló ismert módszer azon alapszik, hogy a glükózt a glükózoxidáz enzimmel reagáltatják és a reakciót a peroxidáz segédenzim vagy ehhez hasonlóan ható anyag jelenlétében alkalmas indikátorokkal láthatóvá teszik (csík-teszt). A kapott színreakciók szemmel vagy fotometrikusan kiértékelhetők. Alacsony glükóz-koncentiációk esetén a színreakciók differenciálhatok, de növekvő glükóz-koncentrációval, az orvosilag fontos tartói lányban a minősítés egyre nehezebb lesz, és az eddig ismert csík-tesztek már nem egyértelműen kiértékelhetők. Ez arra vezethető vissza, hogy az ismert megoldások esetén a reakcióhoz szükséges komponensek egyetlenegy zónában vannak jelen, és az összes reakció egyszerre zajlik le. Ezért a szubsztrátum növekvő mennyiségével a mikrokörnyezetnek és a diffúziónak fontos szerep jut. A 40 667 sz. NDK-beli szabadalmi leírás olyan tesztcsíkot ismertet, amelynek két, illetve három zónája van: felvivő zóna, reakciózóna és kimutató zóna. A csík színes jelölést lehetővé tévő jelölő anyagokat és puffer-anyagokat tartalmazhat. A fenti említett eszköz esetén a glükózoxidáz más zónában helyezkedik el, mint a peroxidáz-indikátorrendszer. A csík a glükóz kimutatására alkalmas, hátránya a már említett : a glükózoxidáz enzim a vizsgált folyadékkal és a szubsztrátummal, illetve annak reakciótermékével együtt a peroxidáz-zónába diffundál. A két enzim optimális funkciójához szükséges pH-érték nem azonos, így az együttesen felvitt komponensek esetén a körülmények nem optimálisak. Hátrányos továbbá, hogy a képződött színező anyagok idővel tovább oxidálódnak és kevert színárnyalatokat alkotnak, ezért a reakcióidő hosszabbításából sem származik előny. Az említett hátrányokat az ismert eljárásokban zselatin vagy polimerek hozzáadásával, megfelelő pufferek kiválasztásával igyekeznek enyhíteni. A vizuális kiértékelhetőség sárga vagy piros színezőanyag hozzáadásával volt javítható. Az összes ismert teszt kiértékeléséhez vagy színtáblázat, vágj' előzetes etalonmérés után alkalmazható speciális mérőműszer szükséges. A reakcióidő és a leolvasás ideje előírt, máskülönben a színtáblázatot, illetve a mérőműszert nem lehetne alkalmazni, hiszen idővel a színek megváltoznak. A tesztcsík színét nehéz hozzárendelni a színtáblázathoz, ezért a differenciálhatóság rossz. Az ebből és a reakció- és leolvasás-idő be nem tartásából származó hibát az enzimaktivitás csökkenése és a \izsgált anj'agban levő zavaró ténj'ezők még tetézik. így például a vizelet, a szérum és a vér glükóztartalmát nem lehet ugyanazzal a teszt-csíkkal vagjr -fóliával meghatározni, mert az ismert elven alapuló teszt esetében a fehérje-tartalom és a színező anyagok a teszt-eszköz különleges kikészítését teszik szükségessé. A 74 369 sz. NI)K-beli szabadalmi leírás sze- 7Ínt például a reakciózónát víztaszítóvá teszik vagy 3 félig áteresztő réteggel vonják be, vágj' az egész tesztcsíkot impregnálják. A glükóz meghatározásának igen speciális módszerét fejlesztették ki a vizelet maradék glükóz-tartalmának megmérésére. A módszer alkalmazásával különbséget lehet tenni abszolút glükózmentes vizelet és fiziológiás mennyiségű (akár 30 mg/100 ml) glükózt tartalmazó vizelet között (Journal of the American Medical Assosiation, April 15, 1969, Vol. 204—208). E tesztben hordozóként papírt használnak, és ezt 2-dietil-aminoetanollal előkezelik. Az eddig leírt teszt-csíkok nem alkalmasak a 100 ml-ben 40 mg-nál kevesebb glükózt tartalmazó szérum vagjT vér glükóz-koncentrációjának a kimutatására, mert ebben a tartományban a reakció még nem látható. A 40 mg/'100 ml értéknél kisebb koncentráció kimutatása főleg a gj'ermekorvos számára fontos. A reakcióidő és leolvasás idejének pontos betartása mellett egy laboráns nem végezhet sorozatos meghatározásokat, illetve az elvégezhető vizsgálatok száma korlátozott. Ugyanakkor a teszt önkontrollkénti szélesebb alkalmazásának az szab határt, hogy az előírt körülmények között elvégzendő kiértékelés, a színtáblázatok megfelelő kezelése a gyakorlatlan személy, például az öregkori diabetikus ember számára nehéz. A fenti hátrányokat a 137 384 számú NDK-beli szabadalmi leírás szerint azzal igyekeztek kiküszöbölni, hogy a teszt-csíkot alkalmas méretű, műanyagból vágj7 üvegből készült megjelölt kis kémcsőbe (kapilláris csőbe) helyezték. Az említett csík kimutató zónája egy vagy7 több indikátoros jelző zónából és kezeletlen közbenső zónákból épül fel. A találmány célja olyan teszt kifejlesztése, amellyel vizeletben, vérben és szérumban a magasabb glükózkoncentráció mennyiségileg éppen úgy határozható meg, mint a maradék glükóz és a 40 mg/100 ml érték alatti koncentráció. A találmány feladata tehát olyan glükóz-teszt megalkotása volt, amelyben a vizsgálandó folyadék rögzített glükózoxidáz-zónán diffundál át, és mind a reakció, mind a kimutató zónában optimális pH-érték uralkodik. Ezt a feladatot azzal oldottuk meg, hogy a tesztcsíkon levő reakciózónát rögzített glükózoxidázból készítjük. Meglepő módon azt találtuk, hogj7 a glükózoxidáz — aktivitásának lényegesebb csökkenése nélkül —-kielégítő mértékben immobilissá tehető, ha az enzimet az izoelektrikus pont alatti pH-értékű savas oldatban visszük a hordozóra. A teszt-csík itatós jellege — feltétele az alkalmazásának — teljes mértékben megmarad. Természetesen használhatjuk valamilyen ismert módszerrel immobilizált glükózoxidáz .szuszpenzióját is. A találmány7 szerinti teszt-csík egyrészt a legkisebb glükóz-mennyiség meghatározását teszi lehetővé. Másrészt magasabb koncentrációk is differenciálhatókká válnak, mert a vizsgált folyadék a gliikózoxidázt tartalmazó reakciózónán keresztül diffundál, így a szül'-/trat um gátlása ki van zárva. 4 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
