182554. lajstromszámú szabadalom • Eljárás intrvénásan alkalmazható szérumfehérje-készítmény előállítására
3 182554 4 zisztenciafokozó szert, melyet a Cohn-eljárás frakcióiból állítanak elő. A 161 940 számú magyar szabadalmi leírás szerint vérplazma protein frakciókat állítanak elő a proteinoknak az izoelektromos ponton történő egymás utáni kicsapásával, speciális kicsapószer (2-etoxi-6,9-diamino-akridin) alkalmazásával. A fent hivatkozott irodalmi források egyike sem ismerteti a találmány szerinti eljárás lényegét, melynek során a Cohn-frakcionálási eljárás egyes frakcióinak keverésével állítottunk elő magas globulin-tartalmú és így javított hatású készítményt. Ebből adódik az a feladat, hogy az intravénásán alkalmazható szérumfehérje-készítmény előállítására egy olyan eljárást dolgozzunk ki, melynél a kiindulási anyagok kevésbé költségesek és ritkák. Az eljárásnak lehetővé kell tennie, hogy olyan kiindulási anyagokat is felhasználjunk az értékes szérumfehérje-készítmények előállítására, amelyeket eddig nem, vagy csak nem kielégítően lehetett feldolgozni. További feladat, hogy a szérum hatékony antitest- vagy egyéb proteintartalmát specifikusan megnöveljük anélkül, hogy lényegesen növelnénk az előállítási költségeket. Ezen feladat megoldása azáltal válik lehetővé, hogy a nevezett eljárásnál kiindulási anyag gyanánt olyan humán-vérplazma frakciókat alkalmazunk, amelyeket a humán-szérumból egy vagy több frakcionálási lépés alkalmazása után nyertünk. Ezek a lépések az egyes vérprotein-komponensek dúsítására, illetve izolálására szolgálnak, miközben ezek a komponensek lényegében véve natív formájukban megmaradnak. A találmány szerint úgy járunk el, hogy a Cohn-frakcionálási eljárás III/l és/vagy III/2 frakcióit, valamint az I, II és/vagy IV frakciókat valamely kémiailag és fiziológiailag megfelelő hordozóanyagban oly módon keverjük össze hogy az albumin-globulin arány 23—50:50—77 súly% között legyen, majd a kapott készítményt önmagában ismert módon tisztítjuk és stabilizáljuk. A találmány szerinti eljárásnál a Cohn-féle vérfrakcionálásnál eddig nem vagy csak tökéletlenül tovább feldolgozható bizonyos frakciók felhasználhatók. A Cohn-féle eljárás a vérplazma etanol lecsapószerrel, meghatározott hőmérsékleti, pH, ionerősség és etanol-tartalom értékek mellett történő frakcionálásán alapul. A Cohn-féle eljárás például a következő irodalmi helyeken található meg: J. Amer. Chem. Soc., 72, 465—474 (1950), J. Amer. Chem. Soc., 68, 459—475 (1946), valamint a 2390074 és a 2469193 számú Amerikai Egyesült Államok-beli szabadalmi leírások. A leíráshoz tartozó folyamatábrán bemutatjuk az egyes eljáráslépéseket. A folyamatábrán az „etanol... %” mindig térfogatszázalékokat jelent, amelyet 25 °C-on mérünk. A kiindulási plazmát véradók véréből nyerjük. Minden esetben 500 ml humán vért 50 ml 4%-os nátrium-citrát-oldatban fogunk fel. Először elválasztjuk a plazmától a vér alakos elemeit. A folyamatábra „a” lépésében a plazmából eltávolítjuk a nyers fibrinogént oly módon, hogy hideg 53,3%-os etanolt adunk hozzá 8% koncentrációig. A hőmérsékletet —2,5 °C—3,0 °C értéken tartjuk. A „Pl” csapadékot — fibrinogén — centrifugálással távolítjuk el. Az ,,S 1” szupernatánst dolgozzuk fel tovább. A „b” lépés ismét 53,3%-os etanolnak a felül levő ,,S 1” szupernatánshoz való hozzáadását jelenti egészen addig, míg a folyadékban 18—25% etanol-koncentrációt érünk el. A hőmérsékletet —5 °C-on tartjuk és a pH-értéket 5,8-ra állítjuk be. Kiválik a „P 2” csapadék, melyet II/III frakcióként vagy y-globulinfrakcióként jelölünk. Ez a csapadék tartalmazza az immunglobulinokat és az egyéb fiziológiailag fontos proteineket. A „P 2” csapadékot —5 °C-on végzett centrifugálással távolítjuk el. A felül levő „S 2” szupernatánst dolgozzuk fel tovább. A „c” lépés az „S 2” szupernatáns további kezelését tartalmazza. Az etanol-koncentrációt 40%-ra állítjuk be. A „b” lépéshez hasonlóan a hőmérsékletet —7°C- ra és a pH-értéket 5,8-ra állítjuk be. Centrifugálás útján nyerjük a „P 3” csapadékot, amelyet IV-frakciónak is neveznek. Az utóbbi tartalmazza az a- és a ß-globulinokat. A felül levő folyadékot, az „S 3” szupernatánst kezeljük azután tovább. Ehhez a következő körülményeket tartjuk be: hőmérséklet —7 °C, pH=4,8 és az etanol-koncentráció = 40%. Ekkor a „P 4” csapadék, az úgynevezett nyers albumin válik ki, amit önmagában ismert módon tisztítunk és sterilizálunk. A felül álló folyadékot, az „S 4” szupernatánst elöntjük. A II/III y-globulin-frakciót a következő lépésekkel dolgozzuk fel tovább : A „P 2” csapadékot 7,0—7,4 pH-jú citrát-foszfátpufferrel felvesszük. A hőmérséklet 15 °C-os. Ekkor 3% polietilénglikol 4000, illetve 2,5% polietilénglikol 6000 jelű terméket adunk hozzá. A gyakorlatban alkalmazott polietilénglikol nem illékony polietilénglikolok keverékéből áll, amelyek mind vízben, mind szerves oldószerekben oldhatók és molekulasúlyuk a 4000-től 20 000-ig terjedő tartományban van. Az ilyen 4000 közepes molekulasúlyú polietilénglikolok keverékét jelölik „polietilénglikol 1000”-nek. Alapos keverés és 1/2—4 órás reakcióidő után a keveréket centrifugáljuk. Ekkoraz „S 5” szupernatánst és a III—1 frakciót („P 5” csapadék) kapjuk. Az ,,S 5” szupernatánst módosított körülmények között (pH = 4,6 ; polietilénglikol 4000 mintegy 5,5%-ig; hőmérséklet =15 °C) mégegyszer kezeljük és frakcionáljuk. Ekkor a III—2 frakciót („P 6” csapadék) valamint az ,S 6” szupernatánst kapjuk, amely főként az IgG immunglobulint tartalmazza. A III—-1 és III—2 frakciók globulinjai lényegesen feldúsultak az IgG, IgA és IgM immunglobulinokban. Továbbá az ocj-antitripszin, az a^-haptoglobin, a cöruloplazmin, a transzferrin és a hemopexin feldúsult formában van jelen. A III—1 és III—2 frakciókat általában nem dolgozzuk fel tovább. Ezek nagy mennyiségben állnak rendelkezésre, mivel a vérből elsősorban az albumint nyerik ki, és a y-globulinok csak alárendelt szerepet játszanak. A találmány szerinti eljáráshoz kiindulási anyag5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 4
