182544. lajstromszámú szabadalom • Eljárás hidroxi-alkil-purinok aminoalkanollal és p-acetamido-benzoesavval alkotott komplexei előállítására
182 544 tenyésztésre alkalmas műanyag tálca) tenyésztjük tovább másodlagosan. A tálcák 24 sík fenekű süllyesztett üreges részt tartalmaznak, amelyek mindegyikének 3 ml a térfogata,; minden egyes süllyesztett üregbe 1 ml sejtszuszpenziót adunk. A következő napon a tápoldatot eltávolítjuk, és friss szaporító táptalajjal pótoljuk. Az egyrétegű kultúrákat akkor használjuk fel a kísérletekhez, amikor csaknem összefüggőre nőttek már (körülbelül 3—4 nap). Mikor a Linbro-tálcás HeLa sejtkultúrák (egyrétegű daganatsejtek) már készek a kísérletekhez, a tápoldatot leöntjük, és 1 ml olyan fenntartó táptalajt (3%-ra csökkentett mennyiségű borjúembrió szérumot tartalmazó minimál táptalajt) adunk 4 növekvő kultúrához egy tálcán belül, amely adott koncentrációban tartalmazza a vizsgálandó vegyületet. A különböző vegyületeket 2,3-tól 150 pg/ml koncentrációtartományban alkalmazzuk. Kontroll kultúrákhoz egyedül a fenntartó táptalajt használjuk. A vegyület és a kontroll táptalaj beadagolása után 0,1 ml hígított vírus-szuszpenziót adunk a kísérleti csoportokhoz és a fertőzött kontroll kultúrákhoz. A nem fertőzött kontroll kultúrákhoz egyedül sóoldatot adunk. A Linbro-tálcákat utána 37 °C-on 18 órát inkubáljuk, ezután a tápoldatot minden csoportról leszívatjuk. Minden egyes kultúrát egyszer mosunk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS). A sóoldatot leszívatjuk, és minden egyes kultúrához 0,5 ml 0,4 térfogat%-os tengerimalac vörösvérsejt szuszpenziót adunk foszfáttal pufferolt sóoldatban. A kultúrákat 30 percig hagyjuk állni szobahőfokon, ezután az oldatot eltávolítjuk, és a kultúrákat kétszer mossuk foszfáttal pufferolt sóoldattal, hogy a specifikusan kötött vörösvérsejtek kivételével mindent eltávolítsunk. A harmadik mosás után fenntartó táptalajt adunk az összes kultúrához. Egy Nikon fordított fáziskontraszt mikroszkóp okulárjába Howard mikrométer szemlencsét (C 8385) helyezünk. Minden egyes kultúrát megvizsgálunk egy 4-szeres nagyítású nagyítóval, és a hemadszorbeált vörös sejteket közvetlenül megszámoljuk a szemlencse rácsozatát használva területmértéknek. A kapott számtól és a fertőzött kultúrákban levő hemadszorbeált sejtek sűrűségétől függően kísérleti csoportonként részleges vagy teljes területeket jegyzünk fel. A hemadszorbeált sejtek számolására a legjobb körülményeket 60-szoros vagy 150-szeres nagyításnál kapjuk. A 60- szoros és 150-szeres nagyításoknál területhelyesbítő faktorokkal számolunk. A 60-szoros nagyításnál az összterületet 55,5 sokszorozó faktorral számoljuk. A 150-szeres nagyításnál 273 a sokszorozó faktor. Az 55,5 és 273 sokszorozó faktorok adják meg az összterületet a 60-szoros, illetve 150-szeres nagyításoknál. A leszámolt területek száma üregenként 3-tól 5-ig terjed, és minden egyes kezelt csoportban 3—4 üreget számolunk. 21 Biológiai aktivitás Herpes ellenes hatás. (Folt-meghatározás.) A szövetkultúra sejtek Herpes vírussal való fertőzése sejtoldódást okoz. Egy idő múlva ezek az oldott sejtek apró világos területként (folt) válnak láthatóvá a sejtrétegen. A vizsgált anyagnak a táptalajba való adagolása csökkenti a foltok számát, ha képes a vírus szaporodásának gátlására. A módszer a következő : Vírus. Herpes hominis 2. típusú vírust használunk, amely az American Type Culture Colleetion-ből (ATCC) (Bethesda, Maryland, ATCC No. VR 540, Lot 3 D) származik. A liofilizált vírus-szuszpenziót 1 ml steril desztillált vízzel állítjuk helyre. A vírust kétszer tenyésztjük HeLa sejt egyrétegű tenyészeten. A sejtkultúra felülúszóját egyesítjük, 1 ml-es aliquotokra osztjuk, és —70 °C-on tároljuk. Ennek a törzs-szuszpenziónak a titerét 10“4 TCII)50/0,1 ml-nek (TCTD50 = tumor sejt ID^) találtuk. (2 nap inkubálás.) Herpes vírus foltmeghatározás. Logaritmikus fázisban levő verő sejteket (afrikai zöldmajom vesesejtek) tenyésztünk másodlagosan lXlO5 sejt/ml koncentrációban 50 ml-es Falconpalackokban Eagle-féle minimál táptalajban (MÉM), amelyhez 10% borjiiembrió-szérumot (FCS) és antibiotikumokat adtunk. A tápoldatot a szaporítást követő napon lecseréljük. Az erő egyrétegű tenyészetek a szaporítást követő második napon összefüggővé nőnek a logaritmikus fázisban levő sejtekkel, ezeket a kultúrákat használjuk a foltmeghatározáshoz. A tápoldatot kiöntjük, és az egyrétegű tenyészeteket egyszer mossuk foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS). A vírus törzsszuszpenzióból több különböző hígítást készítünk, és minden egyes tenyésztő palackot megfertőzünk FCS-mentes közeghez adott vírushígítások valamelyikének 0,5 ml-ével. Ez a közeg 150 ug/ml koncentrációban tartalmazza a vegyületet. A kontrollokat a vegyületet nem tartalmazó táptalajjal készítjük. A vírus adszorpciót 37 °C-on 2 óráig hagyjuk lefolyni, amely idő alatt a kultúrákat 15 percenként enyhén megkeverjük. Utána a tápoldatot kiöntjiik, és az egyrétegű sejttenyészeteket egyszer mossuk 10 ml foszfáttal pufferolt sóoldattal (PBS). 50 ml foszfáttal pufferolt sóoldattal 6 súly/tf°0-os agarózt készítünk. Készítünk 2% FCS-t tartalmazó minimál táptalaj törzsoldatot. A törzsoldat egy részéhez 150 ug/ml-nek megfelelő mennyiségű vizsgálandó vegyületet adunk. A három oldatot 47 °C-on tartjuk. Ezenkívül 1:10 hígítású humán anti-herpes szérumot készítünk elő. Közvetlenül a vizsgálat megkezdése előtt 15 ml agaróz oldatot adunk 85 ml tápoldathoz. További 15 ml agaróz oldatot adunk 85 ml olyan tápoldathoz, amely vizsgálandó vegyületet is tartalmaz. A lemosott egyrétegű sejttenyészetek mindegyikét egyik kísérletsorozaton belül vagy 5 ml agaróz-oldattal vagy 5 ml vizsgálandó vegyületet tartalmazó agarózoldattal kezeljük. Egy másik kísérletsorozatban az egyes egyrétegű sejttenyészeteket vagy 0,2 ml anti-22 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 12
