182537. lajstromszámú szabadalom • Eljárás specifikus vér koaguláló faktor elkülönítésére polieleaktrolitokkal
182537 26 centrifugacsőben. A keverést kisméretű mágneses keverőrudacskával végezzük. 8. A 7. lépés szerint előállított diszperziót 5 percen át percenként 2000-ret forduló centrifugában centrifugáljuk, majd kiöntjük a felülúszót. 9. 10 ml 0,154 mólos nátriumklorid oldatot adunk az üledékhez, majd 1,0 vagy 0,1 n nátriumhidroxid oldattal 5,8-re állítjuk be a pH-ját. 10. A 9. lépésben előállított diszperziót 5 percen át percenként 2000-ret forduló centrifugában centrifugáljuk, majd kiöntjük a felülúszót. 11. A 6. lépésben megkapott IX faktort nem tartalmazó plazma pH-ját 5,8-re állítjuk be 1,0 mólos citromsavval. 12. A 11. lépés szerint előállított plazmaminta 10ml-éhez hozzáadjuk a 10. lépés szerint kapott polielektrolit üledéket. 20 percen át 5,8 pH-n keverjük a szuszpenziót. 13. 5 percen át percenként 2000-es fordulatszámú centrifugában centrifugálunk. 14. Megfelelő mennyiségű felülúszót kiveszünk a 13. lépésben kapott felülúszóból a nem adszorbeálódott VIII faktor mérésére (a mérés módszerét a 15. példában ismertetjük). A fel nem használt felülúszót kiöntjük. 15. 10 ml 0,154 mólos nátriumklorid oldatot adunk a 13. lépésben előállított polimer-VIII faktor komplexhez, majd 5 percen át keverjük, centrifugáljuk, és a felülúszót kiöntjük. 16. 10 ml 1,7 mólos nátriumklorid oldatot adunk a 15. lépés végén kapott polimer-VIII faktor komplexhez, majd 0,10 mólos citromsavval 6,0-ra állítjuk be a szuszpenzió pH-ját, amikor a VIII faktor eluálódik a polimerről. 17. 20 percen át keveijük a szuszpenziót, miközben pH-ját 6,0-on tartjuk. 18. 5 percen át percenként 2000-ret forduló rotorban centrifugáljuk a készítményt, majd megfelelő mennyiségű felülúszót kiveszünk az eluálódott VIII faktor mérésére. A fölös felülúszót kiöntjük. Megfelelően módosítva az eszközöket a szűréshez, továbbá kis módosításokat alkalmazva a mosási és eluációs lépésekben, a fenti módszer szerint 1 liter plazmából elkülönítjük a VIII faktort (a 6. lépésből származó készítmény), oly módon, hogy 1 liter plazmára számítva 60 g polielektrolitet használunk. A 14. lépésben ismét meghatározzuk a VIII faktor koncentrációját (a nem adszorbeálódott VIII faktor mérése), továbbá meghatározzuk a VIII faktor visszanyerésének mértékét a 18. lépés szerint kapott szűrletből. 15 25 15. példa Kétféle kísérletet végzünk az előzőleg leírt gyantákkal, annak megállapítására, hogy 1. milyen mértékben nyeljük vissza (összehasonlító kitermelés) a VIII faktort (AHF) a 14. példában megadottak szerint eljárva nem hígított emberi plazmából; továbbá 2. megállapítjuk az előállított VIII faktor aktivizálódásának mértékét. 1. A VIII faktor visszanyerése vagy kitermelése Kétfázisú mérést használunk az AHF (VIII faktor) meghatározására, amely a Biggs és Douglas [The Thromboplastin Generation Test (TGT, J. Clin. Pathol., 1, 15—22, 1953)] trömboplasztin-generációs vizsgálatának módosítását jelenti. Röviden szólva úgy járunk el, hogy meghatározzuk egy standard szubsztrált plazma (frissen gyengén ülepszik) alvadási idejét, miután meghatároztuk egy más forrásból származó véralvadási faktor-komplex szabályozott adagolásával kiváltott alvadási idő átlagos értékét. A TGT in vitro alvadási idejéhez (12—20 másodperc) szükséges faktorok a XII, XI, IX, VIII, V faktorok, foszfolipid és kalciumklorid. Ezeket a faktorokat a kalciumkloriddal adjuk a szubsztráthoz. A XII, XI és IX faktorokat humán szérummal adagoljuk, a V faktort boíjú szérummal és a foszfolipidet. kloroformos emberi agy kivonattal; az adagolás a 0 percben történik. A szubsztrált plazma alvadásának idejét automatikusan mérjük. Friss plazma-kontrolit a (VIII faktor elválasztásához használt plazma) vagy AHF eluátumokat adunk megfelelő hígítás után mérhető VIII faktorként, mégpedig a szubsztrát plazma mérés előtti adagolása előtt. Ismert AHF-tartalmú plazmával, amelyet előzőleg Squibb-készítménnyel (Bureau of Biologies) sztenderdizáltunk, és amely milliliterenként 1 AHF egységet tartalmaz, standard görbéket veszünk fel. A standard görbék kijelölik az alvadási időt másodpercenként az AHF milliliterenkénti aktivitásának függvényében logaritmikus-logaritmikus papíron ábrázolva az eredményeket. Ezekből a sztenderd görbékből kiszámíthatók a vizsgált minták AHF-tartalma egység/ml-ben. Mindennap új görbéket veszünk föl a napi AHF-meghatározásokhoz. Az egész mérés során mérjük az időt és szabályozzuk a hőmérsékletet, a szabályozást BBL Fibrometer Fibro System TM készülékkel (BBL Division of Becton, Dickinson and Co., Cockeysville, Maryland, USA) végezzük, amely két melegítőegységgel és órával szabályozható automatikus pipettával van felszerelve. 2. Az AHF aktivizálódásának mérése A mérést az AHF (VIII faktor) relatív aktivációs idejének meghatározására végezzük, amely a plazmán kívül következik be; a mérés a fent ismertetett részleges tromboplasztin idő mérésével történik. Ezen mérés során csak kalciumkloridot és foszfolipidet adunk az ülepített szegényes plazma-szubsztráthoz. Az alvadási időt BBL Fibrometer-rel határozzuk meg, oly módon, hogy megfelelő AHF-hígításokból mérünk be a plazma-szubsztráthoz. A nem aktivált plazma-kontroli az ilyen körülmények között kivitelezett méréskor 190 másodpercnél nagyobb alvadási időket ad. A 150 másodpercnél rövidebb alvadási idők azt jelentik, hogy a véralvadási faktor aktiválódott, vagy aktiváló enzimek vannak jelen. Minden aktivációs meghatározáskor két olyan kontrollt használunk, amelynek aktivációs ideje gyors, használunk továbbá plazma és vak, azaz pufferos kontrollt is. 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 14
