182500. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén interferon előállítására
13 182500 14 16 000 és 18 000 között vannak, a ß3 és a y4 kivételével, ugyanis ß3 egyik sávja 16 500-nál, másik sávja 21 000-nél van, és y4 21 000-nél sávot mutat (lásd 4. táblázat). A tisztított humán leukocita-interferon frakcióinak aminosav-elemzését fluorescaminos aminosavanalizátorral végezzük 0,1—1 gg-nyi mintákon. A redukáló hidrolízishez 6 mólos sósav-oldatot és 0,1% tioglikolsavat alkalmazunk. Az eredménye- 5 két az 5. táblázatban adjuk meg. 4. táblázat Molekulasúly ±1000 Fajlagos aktivitás MDBK*sejteken (szarvasmarha ; egység/mg) + 25% Fajlagos aktivitás Ag 1732 sejtsoron (humán sejtek, egys/mg) + 50% Növekedésgátló aktivitás** «1 16 500 2,6 X 108 2,6 XlO8 ± 16 200 4 XlO8 co X o 00 ± ß. 16 500 4 XlO8 2 X 108 ± 21 000 4 X108 3 XlO8 ± Yi 17 700 2,6 XlO8 2 X108 ± Ys+ 17 700 4 XlO8 1,5 XlO8 ± Y 3 17 200 3,5 XlO8 1,5X 108 ± Ya 21 000 3,5 XlO8 4 XlO7 ± Ys+ 16 000 0.9X108 2 X106 ± + Az NaDodS04-dal poliakrilamidon végzett gélelektroforézis 2 sávot mutat. A megadott érték a fősáv értéke. ++ Steward et al. (Nature 262, 300/1976) módszere szerint 5. táblázat: Humán leukocita-interferon aminosav elemzése Fajta «3 ß* ßs + Yi Ï3 Ï3 + Y4 + Ï3 + Mólsúly 16 500 16 200 16 500 21 000 17 700 17 700 17 200 21 000 16 500 Fragmensek 142 139 142 181 153 153 148 180 142 Asx 13,8 11,7 11,5 18,2 13,1 13,3 15,0 17,9 13,8 Thr 7,7 8,3 9,0 9,9 8,4 9,6 8,6 7,3 7,6 Ser 9,2 10,0 10,0 14,5 10,2 7,8 10,1 13,5 9,0 Glx 20,3 20,5 21,9 28,5 23,9 25,0 22,8 27,0 20,8 Pro 6,1 4,9 5,0 5,9 4,5 4,8 4,8 6,5 4,2 Oly 5,1 4,5 5,0 3,6 5,7 5,0 3,2 4,8 4,0 Alá 8,4 8,3 7,9 11,5 8,7 8,1 9,3 10,4 9,3 Val 7,4 6,2 6,7 7,5 7,3 7,0 5,5 7,9 5,1 Met 3,7 3,8 4,4 6,0 4,3 3,9 5,6 4,9 4,7 ILe 7,4 7,0 7,4 9,5 7,9 8,0 6,8 9,7 6,6 Leu 18,0 18,0 18,9 24,4 20,3 20,1 20,5 24,1 19,6 Tyr 4,0 4,0 4,6 5,0 4,8 4,8 3,7 5,0 3,6 Phe 6,9 8,0 8,7 9,9 8,6 9,0 7,2 9,1 6,4 His 3,0 2,8 3,0 3,8 3,7 3,3 2,9 3,8 2,8 Lys 10,5 9,0 8,5 9,3 10,1 10,0 7,6 12,3 12,0 Arg 6,2 7,1 8,0 10,8 8,0 8,5 10,1 8,5 9,0 Cys 3,9 4,0 1,8 2,3 3,3 2,9 3,1 4,1 2,3 + a két sáv elegye A standard deviáció fragmensenként ±1,5 Tripszin-bontás és a fragmensek kimutatása nagynyomású folyadékkromatográfiával A tisztított humán leukocita interferonok 300— 300 pmól-ját 8 pH-jú nátriumhidrogénkarbonátoldatban (50 mmól, 50 ul) oldjuk. Az oldathoz 0,1 [j.g tripszin 2 ul 3 pH-jú sósavval készített oldatát adjuk, és az elegyet 37 °C-on 14 órán át inkubáljuk. 5 gl ecetsav hozzáadása után az elegyet Lichrosorb RP—8 oszlopra (részecskeméret 10 g; 4,6x250 mm) visszüli. Az oszlopot egy órán keresztül n-propanolból és 0,1 mól hangyasav/0,03 mól piridin puffer-oldatból (pH = 3) készített, 0 tf%-tól 40 tf%-ra lineráisan növekvő gradienssel 0,5 ml/perc átfolyási sebességgel eluáljuk. A fragmenseket fluorescaminnal mutatjuk ki. Az eredményeket a 6. táblázatban adjuk meg. A csúcskoncentrációk helyét a gradiens n-propanol tartalmával, a fragmensek méretét az S, M, L betűkkel jelöljük meg, ahol S kicsi, M középső méretű és L nagy fragmenst jelent. A tisztított humán interferon fajtákat olyan 55 60 65 8
