182500. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén interferon előállítására
13 182500 16 6. táblázat A humán leukocita-interferonok triptikus peptidjei Fajta Az eluáló közeg n-propanol tartalma, %-ban 3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 18M, 20S, 21S, 22,5S, 29M 3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,SS, 14,5M, 16S, 18M, 27S, 29M ß' 3L, 4L, 4,2M, 11,5M, 12,5S, 14,5M, 16S, 17,6S, 18M, 29M ß8 3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 10M, 12,5S, 14S, 14,5M, 16S, 18L, 19,5M, 27M, 32M yi 3L, 4L, 4,2M, 4,5S, 5S, 6,SS, 11,SS, 12,SS, 14,SM, 16S, 17,5M, 18M, 29M V* 3L, 4L, 4,2M, 4,SS, SS, 11,SS, 12,5S, 14,SS, 16S, 18L, 29M / 3M, 4M, 4,2M, 11,5M, 12,SS, 13,5S, 14,5M, 16S, 18L, 20S, 32M y, 3L, 4L, 4,2M, 4,5M, 7S, 7,SS, 10S, 11,5L, 12,SS, 14S, 14,SM, 16S, 18L, 24,SS, 25,SS, 32S aminocukor elemzésnek vetettük alá, amely 50—■ 100 pmól aminocukor kimutatására alkalmas. Mindegyik esetben molekulaként egynél kevesebb glukózamin, galaktózamin, illetve mannózamin fragmenst találtunk. Az aminocukrok közelében eluálható számos kis peptid azonban zavarja az elemzést, így nincs kizárva, hogy az aminocukrokhoz hozzárendelt koncentráció-csúcsok részben vagy egészében peptideknek tulajdoníthatók. Végül a tiszta Y2-interferon lebonthatóságát vizsgáltuk 1 nmól mintán kézzel végzett Edman-lebontás, ismételt hidrolízis és fluorescaminos aminosavelemzés útján. Az első két ciklusban aminosavat nem találtunk, 100 pmól tiszta humán leukocita interferont (y2) 20 órán át 37 °C-on leukinaminopeptidással és M jelű aminopeptidázzal kezeltünk. A kezelés a biológiai aktivitást nem befolyásolta, az inkubációs közegben aminosavak nem voltak találhatók. Az indukciós közeg (leukocitás és Newcastle-vírus minimál közegben) felül úszó részét M-aminopeptidázzal kezelve az interferonaktivitás csökkenését nem észleltük. Ez arra utal, hogy az interferon-molekula a tisztítási eljárás előtt már tartalmazott a láncvégeken védett arninocsoportot hordozó aminosavat. Ellenőrzésképpen nyers interferont, tisztított interferont, illetve az inzulin 3-láncát M-aminopeptidázzal inkubáltuk. Míg az inzulin részben bontható volt (kimutatható aminosavak), addig az interferon-aktivitásban nem mutatkozott veszteség. 1 nmól = 10“* mól; 1 pmól = 10-1> mól. 3. példa Az 1. példában leírt módon szarvasmarha-leukocitákat interferon-tennelésre serkentünk, és az interferont egyes fajták alakjában homogenitásig tisztítjuk. 4. példa Az 1. példában leírt módon sertés-leukocitákat interferon-termelésre serkentünk, és az interferont egyes fajták alakjában homogenitásig tisztítjuk. 5. példa Az 1. példában leírt módon juh-leukocitákat interferon-termelésre serkentünk, és az interferont egyes fajták alakjában homogenitásig tisztítjuk. 6. példa Az 1. példában leírt módon ló-leukocitákat interferon-termelésre serkentünk, és az interferont egyes fajták alakjában homogenitásig tisztítjuk. 7. példa Az 1. példában leírt módon kutya-leukocitákat interferon-termelésre serkentünk, és az interferont egyes fajták alakjában homogenitásig tisztítjuk. 8. példa Az 1. példában leírt módon macska-leukocitákat interferon-termelésre serkentünk, és az interferont egyes fajták alakjában homogenitásig tisztítjuk. 9. példa Az 1. példában leírt módon majom-leukocitákat interferon-tennelésre serkentünk, és az interferont egyes fajták alakjában homogenitásig tisztítjuk. 10. példa (a) 2xl08 egység/mg fajlagos aktivitású, homogén humán leukocita-interferon 3 mg-ját 25 ml 5%-os normál humán szérumalbuminban oldjuk. Az oldatot bakteriológiai szűrőn keresztül szűrjük, majd 100 db csíramentes ampullába töltjük. Mindegyik ampulla 6 X106 egység tiszta interferont tartalmaz. A parentális alkalmazásig az ampullákat előnyösen hidegben (—20 °C-on) tároljuk. (b) 1,5 mg kb. 2xl08 egység/ml fajlagos aktivitású homogén humán leukocitá-interferon au a2, b2, Yi és Y2 fajtáit (mintegy tennészetes előfordulásuk arányában) tartalmazó vizes oldat és 100 mg normál humán szérum-albumin elegyét bakteriológiai szűrőn át szűrjük, majd csíramentes körülmények között 100 db ampullába töltjük. Mindegyik ampulla kb. 3x10® egység tiszta leukocitainterferont és 1 mg szérumalbumint tartalmaz. A parenterálisan alkalmazható interferont tartalmazó ampullákat célszerűen hidegben (—20 °C) tároljuk. Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás homogén interferon előállítására, azzal jellemezve, hogy 1. vizes interferon-oldatot oktilcsoportokkal módosított szilíciumoxid-mátríx-alapú, acetát-pufferrel (pH = 7,5) puff erőit oszlopon gyors folyadékkromatografálásának vetünk alá, és acetátpuffer és kis szénatomszámú alkanol — előnyösen n-propanol — 0%-tól lineárisan emelkedő alkanol-koncentráció grádiensű elegyével eluáljuk ; 2. az előző lépésnél kapott interferon-tartalmú frakciókat gliceril-csoportokkal módosított szilíciumoxid-mátrix-alapú, acetát-pufferrel (pH = = 7,5) puff erőit oszlopon gyors folyadékkroma-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 9
