182500. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén interferon előállítására
7 182500 8 vagy állati eredetű interferonok, továbbá egyéb 12 000 feletti mólsúlyú fehérjék tisztítására is. így például a pro-opicatint (mólsúly mintegy 30 000) [vö. : Kimura és tsai, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76, 1756—9 (1969)] a találmány szerinti eljárás alkalmazásával a homogenitásig tisztították. A találmány szerinti eljárás egyéb fehérjék tisztítására való adaptálásához szükséges intézkedések a szakember szakmai tudásához tartoznak. Az interferon-termelés megindítását, az interferon első feldúsítását, frakcionálását, beleértve a gélszűrést is, önmagában ismert módszerek segítségével végezhetjük. Ezen eljárási lépések, amelyek szennyezett interferon vizes oldatát eredményezik, nem képezik a találmány tárgyát. A találmányt eljárás és termék szempontjából az alábbi példákkal szemléltetjük. 1. példa Normál véradók humán-leukocitáiból származó homogén interferon A. Az interferon előállítása Normál véradók (107 sejt/ml) véréből vett leukocitákat 10 mg/ml kazeint tartalmazó szérummentes minimál-közegben a Newcastle-vírus (10 hemagglutinin-egység/ml) jelenlétében 16 órán keresztül inkubáljuk. A kapott átlagos interferontiter 5000 egység/ml. A használt módszerek kisebb módosításokkal az alábbi publikációkban leírtaknak felelnek meg : Mogensen, K. E. és társai, Pharmacology and Therapeutics A, 1977, 369—381; Wheelock, E. F., J. Bacteriol. 92, 1415—1421 (1966); Cantell, K. és társai, Appl. Microbiol. 22, 625—628 (1971). Az interferon-titert a sejtkárosító effektuson alapuló, 16 óra alatt elvégezhető módszerrel határoztuk meg. Az összes interferon-titert egység/ml-ként adjuk meg, a kalibrálási alap a National Institute of Health (USA) humán leukocitainterferonra vonatkozó etalonja volt. B. Az interferon feldúsítása és első frakcionálása Amennyiben másképp nem adjuk meg a hőmérsékletet, 0 és 4 °C közötti hőfokon dolgozunk. Az inkubáció befejeztével a sejteket és sejttöredékeket centrifugálással (15 perc, 500 g) eltávolítjuk. A pH-értéket sósav-oldattal 4,0-re beállítva a kazeint kicsapjuk. 2 óra elteltével az elegyet centrifugáljuk (10 perc, 12 000 g), a csapadékot eldobjuk. A 10 liter folyadékhoz annyi triklórecetsavat adunk, hogy annak koncentrációja 1,5 vegyes-% (súly/térfogat) legyen. Egy óra elteltével a csapadékot centrifugálással (10 perc, 12 000 g) elkülönítjük, majd 50 ml 0,1 mólos nátriumhidrogénkarbonátoldatban feloldjuk. Az oldathoz 0,5 g Triton X—100 vegyszert és 1,5 ml ecetsavat adunk keverés közben, utána az elegyet 0 °C-on 1 órán át, majd —20 °C-on 16 órán át tároljuk. Felolvasztás után a folyadékot 10 percen át 17 000 g-vel centrifugáljuk, a csapadékot eldobjuk. A felül úszó rész triklórecetsav-tartalmát 4%-ra állítjuk be. Egy óra elteltével az elegyet centrifugáljuk (10 perc, 12 000 g), majd a csapadékot 5 ml 0,5 mólos nátriumhidrogén-karbonát-oldatban oldjuk. C. Gólszűrés A kapott töményített interferon-oldathoz 1,5 g karbamidot adunk, majd 4 mól karbamidot és 0,1 mól nátriumacetátot tartalmazó puffer-oldattal egyensúlyba hozott Sephadex G—100 oszlopra (2,6x90 cm) visszük. Az oszlopot szobahőmérsékleten 0,5 ml/perc térfogatsebességgel a fenti 7,5 pH-jú puffer-oldattal eluáljuk. 12,5 ml-es frakciókat gyűjtünk. Interferon-aktivitást a 19—23. frakciók mutatnak. D. Nagynyomású folyadékkal végzett kromatográfia (HPLC) A Sephadex G—100 oszlopról eluált 19—23. frakciókat egyesítve szivattyú segítségével közvetlenül Lichrosorb RP—-8 oszlopra (10 \x, 4,6x250 mm) juttatjuk. Az oszlopot előzetesen 7,5 pH-jú, 0,01 tf% tiodiglikolt tartalmazó 1 mólos nátriumacetát-pufferrel egyensúlyiba hoztuk. Az oszlopot n-propanolból és a fenti pufferból készített lineáris gradienssel (1 óra 0—20 tf % ; 3 óra 20—40 tf-%) 0,25 ml/perc térfogatsebesség mellett eluáljuk, 0,75 ml-es frakciókat gyűjtve. Az interferont a 25—30 tf% n-propanolt tartalmazó 23—40. frakciókban találjuk. A legtöbb interferont tartalmazó 27—33. frakciókat egyesítjük, n-propanol-tartalmukat 80 tf%ra beállítjuk, utána az oldatot szivattyú segítségével közvetlenül Lichrosorb—Diol-oszlopra (10 jx; 4,6x250 mm) juttatjuk, amelyet előzetesen 80 tf-% n-propanolt tartalmazó 0,1 mólos nátriumacetát-oldattal egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot 4 órán keresztül 72—50 tf-% n-propanolt 0,1 mólos nátriumacetát-oldatban tartalmazó lineáris gradienssel 0,25 ml/perc átfolyási sebesség mellett eluáljuk. 0,75 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az interferon-aktivitást három élesen elkülönülő koncentrációcsúcs alakjában eluáljuk. A csúcsokat eluálási sorrendjük szerint a-, ß- és y-csúcsnak nevezzük el. Az a-frakciót 68%-os n-propanol, a /5-frakciót 66,5%-os n-propanol és a y-frakciót 65,5%-os n-propanol tartalom mellett eluáljuk. Az interferon-aktivitás összhozama 80%-nál nagyobb. Az egy-egy csúcshoz tartozó frakciókat egyesítjük és a következő lépésekben külön-kiilön tovább tisztítjuk. Tekintve, hogy a y-csúcs kiemelkedően a legnagyobb, és a többi komponenstől a legjobban látszik elkülönülni, a további tisztításhoz a y-komponenst választjuk. A diol-oszlopról származó 54— 56. frakciókat — amelyek a y-csúcsot tartalmaznak — egyesítjük, és azonos mennyiségű hexánnal kétszer egymás után végzett extrakcióval az n-propanolt eltávolítjuk. A hexán nyomokat nitrogénáramban eltávolítjuk. Az oldathoz annyú piridint és hangy7asavat adunk, hogy7 azok végső koncentrációja 1 mólos, illetve 2 mólos legyen. Az oldatot Lichrosorb RP—8 oszlopra (10 jx, 4,6x250 mm) visszük, amelyet előzetesen 4,0 pH-jú, 1 mól piridint és 2 mól hangyasavat tartalmazó pufferrel egyensúlyba hoztunk. Az oszlopot 3 óra alatt a fenti pufferből előállított és 20—40% n-propanolt tartalmazó lineáris gradienssel 0,2 ml/perc átfolyási sebesség mellett eluáljuk, 0,6 ml-es frakciókat gyűjtve. Az aktivitás fő csúcsa megfelelt egy fehérjecsúcsnak. A 32 tf% propanol-tartalom mellett eluált 45. és 46. frakciót egyesítjük és azonos körülmények között újból kromatografáljuk. Az interferont a 32 tf% propanol tartalom mellett eluált 31. frakcióban találjuk. E frakció fajlagos aktivi-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 5
