182500. lajstromszámú szabadalom • Eljárás homogén interferon előállítására
9 182,500 10 1. táblázat: Humán leukocita-interferon tisztítása Egység xlO-6 Protein, talált (mg) Relatív fajlagos aktivitás (egység/mg) Tisztasági fok Hozam /lépés <%> 1. Inkubációs közeg 50 10 000 5 XlO3 i — 2. 4 pH-jú felülúszó rész 50 2 000 2,5 XlO1 5 100 3. triklórecetsavas (1,5%) csapadék 40 1 000 4X 10“ 8 80—100 4. Triton X-100-as felülúszó rész 40 250 1,6 X 105 32 70—100 5. Triklórecetsavas (4%) csapadék 35 175 2 XlO5 40 80—90 6. Sephadex G—100 32 57 5,6x 105 112 70—90 7. Lichrosorb RP—8 (pH 7,5) 8. Lichrosorb-Diol 28 11 2,5 X 106 500 80—100 ct-esúes 11 1,1 1 X 107 5 000 /9-csúcs 2,5 nincs meghatározva 70—90 y- csúcs 12,5 0,21 6X 107 12 000 9. Lichrosorb RP—8 (pH 4) 1,6 0,0064 3X 108 60 000 40—60 10. Lichrosorb RP—8 (pH 4) 8,2 0,021 4 XlO8 80 000 40—60 Az ebben a frakcióban kapott fehérje azonosításához etalonként marhaszérum-albumint használtunk. A 10. lépés homogén csúcsának aminosav elemzésével meghatározott abszolút fajlagos aktivitás: 2—4xl0B egység/mg(lásd szöveg). A 9. lépésben a 8. lépés y-frekciójától indultunk ki. A 10. lépés kiindulási anyaga több preparátum 9. lépésének egyesített anyaga volt. tása marhaszérum-albuminra vonatkoztatva 4 X 10s egység/ml. Ezt az anyagot használjuk fel a további azonosítási kísérletekhez. A HPLC fluoreszcencprofiljai igen jó reprodukálhatóságuknál fogva jellemzők az egész eljárásra. A tisztítás eredményeit az 1. táblázatban foglaljuk össze. A teljes folyamat hatékonysága — az inkubáció során kapott oldattól a második RP—8 oszlopig — 6000—8000-szeres. Az első lépcső (a Diol-oszlopig) kumulatív hozama 30—50%. Utána a három interferon-fajta külön-kiilön került további tisztításra. E. Poliakrilamid-gélen végzett elektroforézis 1,5 xlO5 egységet tartalmazó interferon-mintákat nátriumdodecil-szulfáttal és 2-merkapto-etanollal inkubálunk és géllemezre visszük. Az elektroforézis után Coomassie-kékkel festve egyetlenegy éles savót kapunk. A látszólagos (etalon fehérjékre vonatkoztatott) mólsúly 17 500. A gélt 1 mm-es csíkokra vágjuk, mindegyik csíkot 0,1% nátrium - dodecil-szulfátot tartalmazó 0,4 ml 0,5 mólos nátriumhidrogénkarbonát-oldatban homogenizáljuk, és az interferon-aktivitást vizsgáljuk. Egyetlenegy vírus elleni aktivitású csúcsot találunk, amely az egyetlen fehérjecsúccsal egyezik. E. Aminosavelemzés A homogén leukocitu y-interferon aminosavelemzését fluorescaminos analizátorral, természetes és S-karboximetilezett interferont tartalmazó, 0,5—1 ug-nyi mintákon végezzük. A cisztein/cisztin arány meghatározására természetes interferont karbometilezünk, majd 6 mólos sósav-oldatban redukáló körülmények (0,1% tioglikolsav) között hidrolizáljuk. E feltételek mellett a ciszteint S-karboximetil-ciszteinként, a cisztint szabad cisztinként mérhetjük. Az aminosavelemzés eredményeit a 2. táblázatban adjuk meg. Az aminosav-tartalomra számított fajlagos aktivitás számítások szerint 2—4x 108 egység/mg. „„ 2. táblázat 25 Humán leukocita-interferon aminosav összetétele Aminosav fragmensek Asx 15,2±1,2 Thr+ 7,5±0,5 Ser+ 8.0-4-0.5 Glx 24,0 ±0,6 Pro 6,3±0,3 Gly 5,5±0,5 Alá 8,2±0,2 Cys (összesen) 3,3±0,7 1/2 cisztin++ 1,8±0,2 cisztein+ + 1,5±0,5 Val 7,8±0,2 Met 3,9±0,2 Ile 8,9±0,4 Leu 21,8±1,3 Tyr 5,1 ±0,2 Phe 9,1±0,3 His 3,3±0,4 Lys 11,8±0,6 Arg 7,3±0,5 Trp+++ 0,7±0,1 °0 + kiindulási időpontra visszaszámítva + + természetes interferon karboximetilezése után mérve + + + 6 mól HCl/4% tioglikolsav elegyében végzett hid- 55 rolízis után mérve. Asx = Asn + Asp Glx = Gin + Glu 60 2. példa Leukémiában szenvedő betegek leukocitáiból nyert leukocita-interferon Krónikus myelógiás leukémiában szenvedő betegek véréből izolált leukocitákat kazeintartalmú 65 szérummentes közegben a Newcastle-vírussal ín-6
