182462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavak keverékeinek affinitáskromatográfiás szétválasztására
11 182 462 12 rinti eljárás alkalmazástechnikai lehetőségei a nukleinsavak frakcionálása területén igen sokoldalúak. A kettősláncú nukleinsavak keverékei a kötött színezék bázisspecifikussága szerint, a nukleinsavak bázisösszetételének megfelelően bonhatók fel. Így például a 2. ábra három, eltérő bázisöszszetételű, kb. 700 000 D közepes molekulasúlyú, széttöredezett, baktérium eredetű dezoxiribonukleinsav elegyének eluciós diagramját mutatja. A szétválasztásához olyan 16 cm X 1,5 cm méretű kromatografáló oszlopot használunk, amely adszorbensként poli-[bisz(akril-amid)]részecskékre ráojtott akril-malachitzöld-akrilamid kopolimert tartalmaz. Az alkalmazott dezoxiribonukleinsav mennyiség kb. 1 mg. A 3. ábra három, eltérő bázisösszetételű, kb. 700 000 D közepes molekulasúlyú, széttöredezett, baktérium eredetű dezoxiribonukleinsav elegyének eluciós diagramját mutatja be. Az 1 mg mennyiségű nukleinsavelegy eluálásához olyan 15,2 cm X 1.5 cm méretű oszlopot használunk, amely adszorbensként olyan poli-[bisz(akrilamid)]-részecskéket tartalmaz, amelyekre akrilfenil-neutrálvörös-akrilamid-keverékpolimer van ráojtva. A találmány szerinti eljárással a restrikciós endonukleázok hatására keletkezett DNA-fragmentumok is frakcionálhatók. E tényt a 4. ábrával szemléltetjük, amely egy lambda-fág-dezoxiribonuklelnsavból származó EcoRI-hidrolizátum (restrikciós endonukleáz I-hidrolizátum) eluciós diagramját mutatja be. E hirdolizátumot 0,5 mg mennyiségben, 15,8 cm X 1,5 cm méretű oszlopon választottuk szét, amely adszobensként olyan poli-bisz(akril-amid)-részecskéket tartalmazott, amelyekre akril-malachitzöld-akril-amid-keverékpolimert ojtottunk. A DNA fragmentumok megjelölés — egybevetve a kiindulási anyaggal — az egyes frakciók gélektroforetikus szétválasztására beiktatott képen, megfelel Thomas és Davis szerzők a J. Mól. Bioi. 91, 315—328 (1975) lapjain megjelent közleményében alkalmazott megjelölésének. ^ A találmány szerinti eljárással ugyanazon élőszervezetekből származó ribonukleinsavak is elválaszthatók a dezoxiribonukleinsavaktól, mint az az 5. ábrából jól látható. Ez az ábra M. Iuteus (72% G+C) feltárásából származó DNA-RNA- elegy eluciós diagramját mutatja be, aholis az elegy 1 mg-nyi mennyiségét 16,2 cm X 1,5 cm méretű oszlop segítségével választottuk szét. Ez az oszlop olyan poli-[bisz(akril-amid)]-részecskékből állott, amelyekre akril-malachitzöld-keverék,polimert ojtottunk. A 6. ábra négy különböző, élesztőből kapott transzfer-ribonukleinsav elegyének eluciós diagramját szemlélteti. Az 1,5 mg mennyiségben szétválasztott elegy esetében t-RNAF*. t-RNA L1*, t-RNA-<’"* és t-RNA011 nukleinsavakból álló elegyről van szó. Az affinitáskromatográfiához 16 cm X 1,5 cm méretű, olyan poli-[bisz(akrilamid)]-részecskékkel töltött oszlopot használtunk, amelyekre akrilnfenil-neutrálvörös^akrilamid-keverékpolimert ojtottunk. A 7. ábra szuperhelikális (supercoiled) és lineáris DNA-szétválasztásának eluciós diagramját mutatja be. Az affinitáskromatográfiához olyan poli-[bisz(akril-amid)]-részecskéket használtunk, amelyekre 9-(akriloil-amino-etil-amino)-2-metoxi-6-klór-akridin-részecskéket ojtottunk. A nukleinsavkeverékek találmány szerinti, affinitáskromatográfiás úton történő szétválasztásánál eluálószerként vizes sókoncentrációgradienseket alkalmazunk, amihez sókként előnyösen alkálifém-sókat, így nátrium-kloridot, nátrium-perklorátot, lítium-perklorátot stb. használunk. Bizonyos esetekben pufferokat is alkalmazhatunk, így például foszfátpufferokat. Ilyenkor például komplexképzőként malachitzöld gyököt tartalmazó adszorbensek esetében, gyengén savanyú, 5,5—6 pH-jú puffert, például 0,01 mólos, 5,5—6-os pH-jú foszfátpuffert használunk. Az optimális sógradiensek kialakítása, ezek összetevői, koncentrációi, pH-értékei, valamint az ezekhez felhasznált pufferok a szakember számára minden további nélkül hozzáférhetők. összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a találmány szerinti eljárás kiválóan alkalmas nukleinsavkeverékek affinitásspecifikus szétválasztására. Az adszorbensek egyszerű módon állíthatók elő. 3. példa. Az akriloil-amino-malachitzöld előállítása la. 15,1 g (0,1 mól) 4-nitro-benzaldehidet és 36,3 g = 38 ml (0,3 mól) N, N’-dimetil-anilint, valamint 40,5 g vízmentes cink-kloridot elkeverünk és vízfürdőn 100 °C-ra melegítünk. A kezdetben könnyen mozgó keverék a reakcióidő során szilárd, zöld, többé már nem keverhető masszává válik. 5 órai reakcióidő után a rendszert hagyjuk lehűlni. A terméket 150 ml aoetonnal felvesszük, miközben bizonyos idő múltán és keverés közben a termék feloldódik és cinksó válik ki. Az oldatlan sót nuccszűrőn leszívatjuk, acetonnal mossuk és a szűrlethez annyi vizet keverünk, amennyivel abban a kristályosodás megindul. A kristályosodott anyagot nuccszűrőn leszívatjuk, majd rendre vízzel, izopropilalkohollal és éterrel mossuk. A kitermelés 28,7 g (az elméleti 76,6%-a). O. p. = 168 °C (a vegyület fényérzékeny). lb. 3,75 g (0,01 mól) mennyiségű, az la. lépés szerint kapott nitro-vegyületet feloldunk 200 ml 99%-os jégecetben és 20 ml vízben és az oldathoz 4 g cink-kloridot adunk. A rendszerhez ezt követően kevérés és hűtés közben, szobahőmérsékleten (20—30 °C) apránként 20 g cinkport adunk. A reakciókeveréket 30 percig szobahőmérsékleten keverjük, majd a felesleges cinket nuccszűrőn leszívatjuk és jégeoettel mossuk. A szűrletet vákuumban 50 °C hőmérsékleten bepároljuk, a maradékot 150 ml kloroformban és 100 ml vízben oldjuk és elválasztjuk, majd a kloroformos fázist 80 ml 2 N-nátrium-5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
