182462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavak keverékeinek affinitáskromatográfiás szétválasztására
9 182 462 10 mok + akril-amid nukleinsavakkal szemben specifikus monomerek ; 2. ábra: Három széttöredezett, bakteriális eredetű dezoxiribonukleinsavak elegyének eluciós diagramja; 3. ábra : Három, széttöredezett, bakteriális eredetű dezoxiribonukleinsav elegyének eluciós diagramja; 4. ábra Lambda-fág-dezoxiribonukleinsavból származó EcoRI (restrikciós endonukleáz I) hidrolizátum eluciós diagramja; 5. ábra: M. luteus feltárásából származó DNARNA-elegynek szétválasztása során kapott eluciós diagram ; 6. ábra: Élesztőből származó, négy különböző transzfer-ribonukleinsavból álló elegy eluciós diagramja; 7. ábra: Szuperhelikális (supercoiled) és lineáris DNA elválasztásának eluciós diagramja. A találmányt az alábbi példákon mutatjuk be részletesebben. 1. példa: A) A poli-[N, N’-metilén-bisz(akril-amid)] hordozóanyag előállítása 50 g N, N’-metilén-bisz(akril-amid)-ot 1 literes magas polietilén főzőpohárban 100 ml metil-alkoholban szuszpendáltatunk, majd hozzákeverünk 200 ml forró, kétszer desztillált vizet. A mágneses keverővei végzett keverés közben a bisz(akril-amid) teljesen feloldódik. A 60 °C-ra lehűtött és erőteljesen kevert oldathoz előbb 1 ml N, N, N’, N’-tertrametil-etilén-diamint adunk pipetta segítségével, majd egyszerre hozzáöntjük 0,2 g ammóniumperoxi-diszulfát“ 5 ml vízben készített oldatát. Az így kapott rendszert átkeverjük, majd a keverőt azonnal leállítjuk. Az oldat néhány másodperc múlva megzavarosodik és melegítés közben színtelen tömbbé szilárdul. A polimerizációt kb. 1 perc múlva megszakítjuk,, oly módon, hogy a polimer tömböt nagy spatulával gyorsan durván felaprítjuk. A kapott töredékeket 2 literes polietilén főzőpohárban vagy mérőhengerben 1 liter metil-alkoholban szuszpendáltatjuk és szemcsés kásává dörzsöljük szét. A részecskék további homogenizálása céljából a kását ezután csökkenő szitaszemnyílású sziták során (1 mmX 1 mm, 0,5 mmX0,5 mm és 0,25 mmX0,25 mm) dörzsöljük át. A keletkezett forgácsokat ülepedni hagyjuk, majd ezt követően a tejszerűen zavaros szupernatáns részt dekantáljuk. Ezt az eljárást több ízben, mégpedig előbb metil-alkohollal, azután metilalkohol—víz eleggyel, majd 1%-os ecetsavoldattal, végül pedig ismét desztillált vízzel megismételjük. A kapott poli-[N, N’-metilén-bisz(akril-amid)]-részecskéket vizes oldatban tároljuk és azok a következőkben leírt ojtásos kopolimerizációban bármikor felhasználhatók. 300 ml polimerizációs oldatból kb. 300 ml leülepedett poli-[N, N’-metilén-bisz(akril-amid)]-részecskét kapunk. B) Akril-amidból és akril-fenil-neutrálvörösből álló kopolimer ráojtása az A) lépésben kapott poli-[N, N’-metilén-bisz(akril-amid)]-ra Az A-lépésben kapott, leülepedett poli-[N, N’metilén-bisz(akril-amid)]-részecskékből 60 mlnyit csavaros záródugóval ellátott palackban 20 ml desztillált vízben szuszpendáltatunk. E szuszpenzióban feloldunk 5 g akril-amidot és 10,3 mg akril-fenil-neutrálvörös-kloridot. E művelet közben a palackban levő szuszpenziót óvatosan rázogatjuk mindaddig!, amíg a színezék tökéletesen fel nem oldódott. A kopolimerizációt ezután a polimerizációfok beállítása céljából 0,050 ml merkapto-etil-alkohol, valamint katalizátorként 1 ml nátrium-peroxdioldat (0,8 g nátriumperoxid 100 ml térfogatú, 1 mólos, 5,5-ös pH- értékű nátrium-aoetát-pufferben) hozzáadásával indítjuk meg. A keletkezett szuszpenzión azonnal, 5 percen keresztül nitrogéngázt vezetünk át, majd azt levegő kizárásával pihentetjük. Kb. 30 perc múltán a reakciókeverék már érzékelhetően felmelegedett, és kb. 2 óra alatt a polimerizáció lényegében véve befejeződik. A rendszert ezután még néhány órán át állni hagyjuk, majd a sűrűnfolyó szuszpenziót nuccszűrőre visszük át. A sűrűnfolyó, sötétszínü oldatot leszívatjuk és a nuccszűrőn visszamaradó, erősen színezett részecskéket vízzel alaposan mindaddig mossuk, amíg a távozó mosóvíz 1%os ecetsavoldat hozzáadásával színtelen nem marad. Az anyagot befejezésül egy éjszakán át folyamatosan 0,01 mólos, 6,0 pH-értékű nátriumfoszfát-pufferral öblítjük. Ezután az anyag a nukleinsvak aífinitáskromatográfiája céljaira már használható. Az akril-amid-kitennelés megállapítására a UC jelzett szénatomos módszert, míg a színezékkitermelés megállapításához az optikai sűrűség módszerét alkalmazzuk. Az így meghatározott kitermelések a következők:1 Színezék: Beépítés a kopolimerbe (kötött és nem kötött) 60,5% Akril-amid: Beépítés a kopolimerbe (kötött és nem kötött) 49,2% Színezék : Beépítés a kötött kopolimerbe, az összegre vonatkoztatva 51,0% Akril-amid: Beépítés a kötött kopolimerbe, az összegre vonatkoztatva 57,0% Hangsúlyoznunk kell, hogy a színezék és az akril-amid közötti kiindulási arány (1:3000) a kopolimerben is megmarad. Minthogy a kopolimer közepes polimerizációfokát 200 és 300 közötti értékben állapítottuk meg, elfogadhatjuk, hogy a kopolimerláncok lánconként mindenkor csak egyetlen színezékmolekulát hordoznak. A fentiekben leírt eljárást vázlatosan az 1. ábrán szemléltetjük. 2. példa. Nukleinsavkeverékek szétválasztása • Amint, azt a 2—6. ábrákon bemutatott eluciós diagramok szemléltetik, a találmány sze5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 6
