182462. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nukleinsavak keverékeinek affinitáskromatográfiás szétválasztására
T 182 tot tartalmazó színezékeket még szabad, kopolimerizálható kettőskötéseket tartalmazó poli-bisz-(akril-amid)-ra ojtjuk. A találmány szerinti eljárás során alkalmazott adszorbenst előnyösen úgy állítjuk elő, hogy komplexképzőként . akril-íenil-neutrálvöröset vagy akril-malachitzöldet, további kopolimerizálható monomerként pedig akril-amidot alkalmazunk, és ezen alkotókból álló kopolimert ojtunk a poli[bisz(akril-amid)]-ra. A találmány szerinti eljárás egyik előnyös foganatosítási módja szerint akril-amidból és akril-fenil-neutrálvörösből vagy akril-malachitzöldből álló, 200 és 300 közötti polimerizációsfokú kopolimert ojtunk fel. Ezen ojtásos kopolimerizációnál a kopolimerizálható kettőskötéssel rendelkező, komplexképző aránya a további kopolimerizálható monomerekhez előnyösen 1:100 és 1:5000 között van. E reakciót célszerűen 1:3000-as aránnyal hajtjuk végre. Megállapítottuk ugyanakkor, hogy a további monomer és a kopolizálható kettőskötéssel rendelkező komplexképző közötti kiindulási mólarány a kopolimerben is megmarad. A kopolimer 200 és 300 közötti átlagos, illetve közepes polimerizációfoka esetében abból indulhatunk ki, hogy a ráojtott kopolimerláncok mindenkor csak egyetlen, nukleinsavak számára komplexképzőt hordoznak. A kopolimerek ily módon különböző hosszúságú spacereket alkotnak a komplexképző és a hordozóanyag, a poli[bisz(akril-amid)]-részecskéi között. A találmány szerinti eljárás során alkalmazott polimer hordozóanyagok szintétikusan egyszerű módon előállíthatok. Így például a polimer hordozóanyagot bisz-akril-amid nagy koncentrációjú oldatban végrehajtott polimerizálásával kaphatjuk meg. A polimerizációs termék merev, színtelen szilárd anyag, amely igen könynyen dörzsölhető szét olyan jól ülepedő forgácsokká, amelyek azután többszöri szitálással a kívánt részecskenagyságig homogenizálhatók. A vizes oldatban észlelhető duzzadási viszonyok, illetve duzzadóképesség szélsőséges sókoncentrációk esetében is állandó(k) és gyakorlatilag független(ek) a kromatográfiánál alkalmazott átfolyási sebességtől. Minthogy e részecskék még számos át nem alakított, polimerizálható kettőskötést tartalmaznak, jól felhasználhatók — amint arra már a megelőzőekben rámutattunk — a további ojtásos polimerizációra. így kapjuk meg az adenin-timin-specifikus akril-malachitzöldből és a guanin-citozin-specifikus akril-fenil-neutrálvörösből az akril-amiddal ilyen poli-[bisz(akril-amid)]-részecskék jelenlétében, vizesoldatban végrehajtott kopolimerizációfokú kopolimer 40—50%-a a szokványos reakciókörülmények. • között ojtott kopolimerként kötődik a poli-[bisz(akril-amid)]-ból a hordozórészecskéken. Alapos öblítés után az erősen színezett adszorbens részecskéik többé már nem adnak le színezékanyagot és már közvetlenül felhasználhatók a nukleinsavak affinitáskromatográfiájához. A nukleinsavelegyet a szokásos eljárási mód szerint 0.01 mólos foszfát-pulleroldatban adszorbeáltatjuk az anyagon, majd 8 arról lineáris sógradiens alkalmazásával deszorbeáltatjuk. Az alkalmazandó só minősége a nukleinsavak jellegétől függ. Amíg a ribonukleinsavak deszorpciójához — ideértve a transzfer-ribonuklinsavakat is — a nátrium-klorid alkalmazása elegendő, a DNA-nak az akril-malachitzöld tartalmú adszorbensekről történő eluálásához perklorát használatára van szükség. Kutatásaink során azt találtuk, hogy hordozóanyagot úgy is előállíthatunk, ha hidroxi-, illetve aminocsoportokat tartalmazó, oldhatatlan, gyöngyalakú anyagokból indulunk ... Előnyös, túlnyomórészt szerkezetspecifikus komplexképző a 9-(akriloil-amino-etil-amino)-2- metoxi-6-klór-akridin, amelynél a gyűrűrendszeren aminocsoport található, amely a DNA foszfátcsoportjaihoz való kapcsolódást lehetővé teszi. Akridinszármazékok, például a 9-(akriloilamino-etil-amino)-2-metoxi-6-klór-akridin a bisz(akril-amid)-részecskékhez történt kapcsolódásukat követően a bázisra nem specifikusan választják el a kettősláncú DNA-t a szuperhelikális (supercolied) DNA-tól (1. a 7. sz. ábra eluciós diagramját). Ez a tény a plazmid- és vírus- DNA-k feltárt sejtekből történő egyszerű leválasztása szempontjából igen fontos. Az oszlop helyettesíti a költséges etidium-bromid-céziumklorid-gradienst. Ezt az elválasztást az akriloilamino-fenil-neutrálvörös-oszloppal is elvégezhetjük, tekintettel arra, hogy a DNA-val mindkét színezék hasonló szerkezetű komplexet (interkalációs komplexet) alkot. Az akriloil-aminofenil-neutrálvörös szerkezet- és bázisspecifikusan is szétválaszt. Ez lehetőséget ad arra, hogy a megoldandó szétválasztási vagy elválasztási problémáknak megfelelően, illetve attól függően, az adszorbens összetételét illetően egy sor változatot alakíthassunk ki. Minthogy a komplexképzők stabil kovalens szén—szén-kötésen keresztül kapcsolódnak, ezért a találmány szerinti eljárásban alkalmazott adszorbensek szélsőségesebb pH-értékeknél is alkalmazhatók, detergensekkel moshatók és sóoldatokkal regenerálhatók. Emellett lehetőség van arra, hogy több, különböző komplexképzőt vagy monomert építsünk be, aminek következtében olyan adszorbenseket alakíthatunk ki, amelyek transzfer-nukleinsavak felbontására is alkalma, sak. A ráojtott kopolimerek lánchossza és ennek következtében a polimer hordozóanyag és a komplexképző közötti láncok hossza a szokásos módon, merkapto-etil-alkohollal irányítható, szabályozható. A találmányt részletesebben példákon mutatjuk be, amelyekben a mellékelt ábrákra hivatkozunk. -Az ábrákon az alábbiakat szemléltetjük: 1. ábra: A találmány szerinti eljárás során előnyösen alkalmazott adszorbensek kétlépéses polimerizációval történő előállításának folyamatvázlata; éspedig 1. polimerizáció: az 1 bisz(akril-amid)-oldat polimerizációjával 2 gél keletkezik, ennek fragmentálásával 3 fragmentumok képződnek, 2. polimerizáció: fragmentu-462 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65
