182442. lajstromszámú szabadalom • Eljárás immunoglobulinok meghatározására
11 182 442 12 ’ D. Az enzim-jelzett F(ab’)2-fragmens (konjugát) készítése Az F(ab’)2-konjugát készítését az I. példa D pontjában leírt módszer szerint végeztük. E. Toxoplazma gondii elleni IgM antitestek kimutatása; mérési módszer I. Bevonás Polivinilklorid mikroelemző lemezek mélyedéseit oly módon vontuk be, hogy hozzáadtunk 9,0-es pH-ju 0,05 mólos IN^CCh/HCl fufferben levő juh anti-human IgM szérum 1/10 000-szeres hígítását és 16 órán át szobahőmérsékleten inkubáltuk. í Ezek után a mélyedéseket 7,2 pH-ju FP-rel, amely 0,05% Tween 20-at tartalmazott (FPTween) háromszor átmostuk. II. Szérum Ezt követően az FP-Tween-ben megfelelő hígításban levő vizsgálandó szérum 0,1 ml-ét hozzáadtuk, és a mélyedéseket 4 óráig 37 °C-on inkubáltuk, majd a mélyedéseket FP-Tween oldattal háromszor látmostuk. III. Antigén A mélyedéseket ,16 órán át, szobahőmérsékleten FP-Tween-ben levő antigén oldat megfelelő hígításának 0,1 ml-ével inkubáltuk, majd ezeket négyszer átmostuk FP-Tween-nel. ÍV. Konjugát Ezután megfelelő hígítású FP-ben anti-toxoplazma F(ab!)2-konjugát 0,1 ml-ét vittük a, mélyedésbe, ezeket 1 óráig 37 °C-on inkubáltuk, majd a mélyedéseket FP-Tween-nel ötször átmostuk. V. Szubsztrát A szubsztrát oldatot (az I. példa V. pontjában leírt módszer alapján készítettük. 0,1 ml szubsztrát oldatot pipettáztunk valamennyi nyílásba, és 30 percig szobahőmérsékleten sötétben inkubáltuk. A reakciót úgy állítottuk le, hogy valamennyi mélyedésbe 0,1 ml 4 n H2S04-et cseppentettünk. Ví. Színváltozás mérése A mélyedésekben történő színváltozás mint a szubsztrát oldat extinkcióját 492 nm-nél Vitatron fotométerrel mértük. VII. Az eredmények kiértékelése 5 negatív kontrollt egyidejűleg vizsgáltunk meg a fentiek szerint. Ezeknek a negatív kontrolloknak 2,1-szeres átlagos extinkoiós értékét találtuk határértéknek a pozitív és negatív eredmények között. IV. példa Toxoplasma gondii elleni IgM antitestek kimutatására szolgáló módszer az antigén és jelzett antitest-fragmens alkotta konjugát alkalmazásával. A) A III. példa E. I. részében ismertetett módon polisztirolból készült mikroelemző lemezeket a III. példa A. részében ismertetett módon előállított juh anti-human IgM immunoglobulin oldatával vonunk be. B) A III. példa B. részében ismertetett módon olyan Toxoplasma gondii antigén-oldatot készítünk, amely milliliterenként 10 mikrogramm antigént tartalmaz. Ugyanakkor a III. példa C. részében ismertetett módon juh anti-toxoplazma készítményt, azaz F/ab’h-fragmenseket készítünk, és az I. példa D. részében ismertetett módon torma-peroxidázzal jelezzük. Az, így kapott oldatot ezután ezerszeresére hígítjuk. Elkészítjük ezt követően az antigén ps a jelzett F(ab’)2-f ragmens konjugátját úgy, hogy az antigén-oldatból 1 ml-t és a jelzett antitest-fragmens oldatából ,1 ml-t összekeverünk. Néhány peroen belül végbemegy a két komponens kapcsolódása. A reakcióelegyet ezután fagyasztva szárítjuk, és az így .kapott terméket felhasználásig tároljuk, illetve közvetlenül felhasználás előtt visszük oldatba. C) A bevonatos mikroelemző lemezek mélyedéseit ezután feltöltjük 100—.100 mikroliter olyan humán vérszérummal, amelyet előzetesen százszorosára hígítottunk a korábban már többször említett, 7,2-es pH-ju FP-Tween pufferrel. 1 órán át 37 °C-on végzett dnkubálást követően a mélyedéseket kiürítjük, majd négyszer FP-Tween pufferrel mossuk. D) A B. rész szerint előállított és újraoldott 100 mikroliter konjugátot adagolunk minden egyes mélyedésbe, majd 37 °C-on 1 órán át inkubálást végzünk. E) A mélyedéseket kiürítjük, majd FP-Tween pufferrel négyszer átmossuk. F) A mélyedésekbe tetrametil-benzidin és hidrogén-peroxid elegyéből álló szubsztrátumot adunk. 30 perc elteltével a reakciót 4 mikroliter 4 n kénsavoldat adagolásával megállítjuk. A mélyedésekben elszíneződés — ami kétszerese a negatív kontrollal inkubált mélyedésekben észlelhetőnek —jelzi a specifikus, Toxoplasma gondii elleni IgM antitestek jelenlétét. V. példa Reagens csomag anti-HAV-IgM meghatározására. Az anti-HAV-IgM meghatározására alkalmas reagens csomag 10x12 vizsgálatra (beleértve a kontrollszérumok meghatározását is) alkalmas és az alábbi komponensekből áll: — 2 tartó egyenként 8 mikro ELISA csíkokkal. iA csíkok mindegyike 12 tesztmélyedést tartalmaz, amelyeket juh anti-humán IgM- el vontunk be. — 16 ampulla, amelyek torma-peroxidázzal jelzett humán anti-HAV-F(ab’)2-t tartalmaznak fagyasztva szárított állapotban. — 1 fiola, amely 5 ml koncentrál HAV antigént tartalmaz — 1 palack, amely 100 ml koncentrál foszfátpuffért tartalmaz — 1 fiola, amely 8 db karbamid-peroxid tablettát tartalmaz — 1 fiola, amely 20 db O-fenilén-diamin-hidroklorid tablettát tartalmaz — 1 fiola, amely 0,25 ml negatív kontrollt 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 7
